[发明专利]一种捻转血矛线虫Hc-H11-2重组蛋白的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种捻转血矛线虫Hc-H11-2重组蛋白的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取捻转血矛线虫RNA，反转录成cDNA；

(2)设计引物Hc-H11-2-F和Hc-H11-2-R，以cDNA为模板，PCR扩增Hc-H11-2基因；

(3)对PCR产物纯化回收，将回收得到的DNA片段与pTOPO-Blunt Simple载体进行连接转化，阳性克隆扩大培养，质粒回收；

(4)设计引物Hc-H11-2-IgK-arm-F和Hc-H11-2-His-arm-R，以步骤(3)的质粒为模板，扩增出含有IgK信号肽及His标签的DNA片段，与pcDNA3.1(+)载体同源重组，菌液PCR鉴定正确后去内毒素大提质粒，获得pcDNA3.1(+)-Hc-H11-2-IgK质粒；

(5)将pcDNA3.1(+)-Hc-H11-2-IgK质粒转染CHO细胞，收集细胞培养液进行His-tag重组蛋白亲和纯化，透析浓缩后得到目的蛋白。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述Hc-H11-2-F和Hc-H11-2-R的引物序列为：

Hc-H11-2-F：ATGACGGCGGAGTGGCAGAAG

Hc-H11-2-R：CTATGATCTTGCTCTCTTGAAGAATTCCG。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述Hc-H11-2-IgK-arm-F和Hc-H11-2-His-arm-R的引物序列为：

Hc-H11-2-IgK-arm-F：CTAGCGTTTAAACTTAAGCTTATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTACTCGTAAAGCATTCGATACCACAC

Hc-H11-2-His-arm-R：TGCTGGATATCTGCAGAATTCCTAATGATGATGATGATGATGTGATCTTGCTCTCTTGAAGAATTCCG。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(5)所述的转染中，所用的转染试剂与质粒的比例为3：1(μl：μg)。

5.一种捻转血矛线虫重组亚单位疫苗，含有捻转血矛线虫Hc-H11-2重组蛋白与佐剂，其特征在于：所述捻转血矛线虫Hc-H11-2重组蛋白是按权利要求1-4任一项所述方法构建的。

6.如权利要求5所述的捻转血矛线虫重组亚单位疫苗，其特征在于：所述佐剂为QuilA，所述重组蛋白与佐剂的质量比为1-2：5。