[发明专利]牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用

说明书

牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用，涉及基因工程技术领域，本发明的牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法包括以下步骤：步骤一、引物的设计与合成；步骤二、asd‑kan融合基因的PCR扩增；步骤三、pMD18‑asd‑kan缺失载体的构建；步骤四、A19‑Δasd缺失菌株的构建。本发明通过基因工程技术定点敲除布鲁氏菌A19菌株的asd基因，构建了asd基因敲除营养缺陷型布鲁氏菌，经过实验证实，该牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株具有良好的安全性和免疫学特性，可作为预防布鲁氏菌感染的候选疫苗菌株。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种全世界广泛流行且危害严重的人畜共患病。近些年来，布鲁氏菌病的发生呈上升的趋势。不但危害着公众的健康，也极大地制约了畜牧业的发展。

使用疫苗免疫是防控布鲁氏菌病的一项重要措施。目前市场上使用的布鲁氏菌疫苗主要是活毒弱疫苗，如我国广泛使用的布鲁氏菌疫苗A19、M5、S2等，这些疫苗存在着安全性不好、副作用较强等缺陷，如A19疫苗株疫苗免疫后可能引起怀孕母畜流产，还会传染人。而基因缺失疫苗具有毒力进一步减弱、安全性高、遗传背景清楚、免疫效果好而又不干扰诊断等特点，因此被科学家们广泛关注。

天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶(aspartate L-semialdehyde dehydrogenase，ASD)为二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)生物合成途径中的必需酶，DAP是革兰氏阴性菌合成菌壁的重要化学成分。如果将编码ASD的编码基因(asd)敲除，在无外源DAP条件下，革兰氏阴性菌不能形成完好的菌壁，而低渗溶菌死亡。

截至目前，还未见牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用，所构建的asd基因缺失株具有良好的安全性和免疫学特性，可作为预防布鲁氏菌感染的候选疫苗菌株。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法，包括以下步骤：

步骤一、引物的设计与合成；

步骤二、asd-kan融合基因的PCR扩增；

步骤三、pMD18-asd-kan缺失载体的构建；

步骤四、A19-Δasd缺失菌株的构建。

作为优选的实施方式，步骤一的具体操作过程如下：

根据NCBI数据库中asd基因及其上下游序列设计引物，引物名称及序列如下：

asdkan-N-F：5’-GGAGCCAAACCATGATGCAC-3’；

asdkan-N-R：5’-TTCGCTTGCTGTCCATAAAAATCAGATTGCAAAAGCGC CG-3’；

asdkan-C-F：5’-CTTGACGAGTTCTTCTGACAGGCCAAGGGAATCAGACC-3’；

asdkan-C-R：5’-GCAAAGATGACCTTGCGCTC-3’；

asdkan-F：5’-TTTTATGGACAGCAAGCGAA-3’；

asdkan-R：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAG-3’；

asd-I-F：5’-TAGAGCGGATCGACAAGCAG-3’；