[发明专利]一种基于杂交链式反应和DNA镊子的赭曲霉毒素A双色荧光检测方法

说明书

本发明提供了一种一种基于杂交链式反应和DNA镊子的赭曲霉毒素A双色荧光检测方法。赭曲霉毒素A能与发夹锁定适体结合，触发杂交链式反应产生长的双链DNA。长双链的侧链可以分别与DNA镊子的两个锁紧序列杂交，导致DNA镊子的打开和双色荧光信号的恢复。结果表明，在0.02～0.8ppb范围内线性良好，FAM荧光信号的检出限为0.006ppb，Cy5荧光信号的检出限为0.014ppb，满足实际应用的要求。另外，本发明方法可以极大降低假阳性率。对实际食品样品中赭曲霉毒素A的检测具有良好的性能。

技术领域

本发明涉及赭曲霉毒素A的检测领域，特别是基于荧光的赭曲霉毒素A检测方法领域。

背景技术

赭曲霉毒素A（OTA）是一类真菌毒素，主要由几种不适当储存的食品中的曲霉和青霉产生。赭曲霉毒素A已被证明对人类和几种动物具有肾毒性、肝毒性、神经毒性、生殖毒性和胚胎毒性。许多研究人员发现，赭曲霉毒素A与人类和动物的自发性肾病有关，也会导致肾脏疾病和肝脏肿瘤。由于赭曲霉毒素A在食物和动物饲料中的半衰期很长，因此可以转移到食物链中。它广泛存在于各种日常食品和饮料中，包括牛奶、葡萄酒、啤酒、果汁、豆类、鸡蛋、坚果、干果、谷物和咖啡等。因此，根据实验动物的充分证据，国际癌症研究机构（IARC）将赭曲霉毒素A归类为可能的人类致癌物质（2B组）。因此，欧盟委员会根据不同的食物基质确定了0.5-20μg kg-1的赭曲霉毒素A最大残留量。

到目前为止，已经开发了许多用于赭曲霉毒素A常规检测和鉴定的分析技术，包括高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）以及ELISA分析。在设备完善的实验室中，有高准确度、高灵敏度、高可靠性的标准分析方法。但由于成本高、预处理繁琐、操作人员经验丰富等原因，这些方法受到很大的限制。核酸适体是一种能与靶分子结合的单链核酸，具有很强的亲和力。最近，许多分析方法被用于通过使用适体进行赭曲霉毒素A识别的赭曲霉毒素A检测，包括比色法，荧光法，电化学，表面增强拉曼散射（SERS）等，虽然已经取得了很大的进展，但探索具有超高灵敏度和超高选择性的赭曲霉毒素A检测新方法对于食品安全和公共卫生领域仍具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于杂交链式反应和DNA镊子的赭曲霉毒素A双色荧光检测方法。

本发明包括如下步骤。

一种基于杂交链式反应和DNA镊子的赭曲霉毒素A双色荧光检测方法，包括如下4个步骤：

1）将发夹锁定适体序列，杂交发卡1序列和杂交发卡2序列分别溶解，加热至90度缓慢冷却至室温后，形成各自的发夹结构，其中，发夹锁定适体序列（5’至3’）为GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACACCTGATGTCCGATGCT，杂交发卡1序列（5’至3’）为TCTATATATTGTCCGATGCTCGTAAAGCATCGGACATCAGGGTCCGATGC，杂交发卡2序列（5’至3’）为AAGTCGTATTTACGAGCATCGGACACCTGATGTCCGATGCTCTGCACTTT；

2）将序列①-⑥与含NaCl的PBS溶液混合，形成DNA镊子，其中，序列①-⑥（5’至3’）分别为Cy5-TATATAGTCCTATCTATGATGG CCCC TTTGTAGACTCAGGATTCGACT-DABCYL；FAM-GTCGTAATGACACATCACTAGGCCCCGTTGGAGCGACATTAGTCCGAT-BHQ3；CTAATGTCGCTCCAACAACCATCATAGATAGGAC；ATCCTGAGTCTACAAATACCTAGTGATGTGTCAT；GCATCGGACATATATAGA；AAAGTGCAGATACGACTT；

3）将待测样品与适量发夹锁定适体、杂交发卡1和杂交发卡2溶液的混合物在一定条件下培养2小时；

4）在步骤3）所得溶液中加入适量步骤2）所得 DNA镊子，孵育，荧光分光光度计直接记录FAM和Cy5的荧光信号，利用标准曲线法计算待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度。