[发明专利]胞内劳森菌flgE重组蛋白及胞内劳森菌抗体检测试剂盒

说明书

一种胞内劳森菌flgE重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用该胞内劳森菌flgE重组蛋白制备的试剂盒，特异性高、灵敏度和重复性好，可用于检测胞内劳森菌抗体，于早期发现猪群的感染，检测速度快，能用于猪群LI感染状态的评估，便于指导该菌感染的保护防控。

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，涉及胞内劳森菌flgE重组蛋白，同时还涉及利用该flgE重组蛋白为抗原，建立检测胞内劳森菌抗体的间接ELISA(flgE-ELISA)方法的试剂盒，用于胞内劳森菌flgE蛋白抗体检测，以此判断猪群中胞内劳森菌的感染情况以及对该病的流行情况进行监测。

背景技术

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy，PPE)是由胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis，LI)引起猪的肠上皮细胞增生并导致肠黏膜增厚为主要特征的传染性肠道疾病，该病是集约化养殖场常见疾病之一，对养猪业的危害除偶尔会引起中大猪的急性死亡外，更主要的危害是猪群体中广泛存在的LI慢性感染严重影响了饲料报酬率，给全球养殖业造成了重大的经济损失。自饲料生产企业停止生产含有促生长抗菌类药物的饲料后，根据临床观察发现由LI引起的腹泻明显增多，给养猪业带来了较大的经济损失。

目前国内对该病进行的实验室诊断多是通过PCR或者商品化试剂盒对粪便中的病原菌进行检测，但这些方法仅在检测处于排毒期的猪粪便时才呈阳性，其检测结果一般偏低。若要准确地反映猪群中LI的感染率，LI抗体的检测必不可少。ELISA可以在很短时间内处理大量样本，适合于对群体大规模的感染性调查。国内虽有多个研究表明基于LI重组外膜或表面蛋白建立的ELISA抗体检测方法具有较好的特异性和敏感性，但目前国内尚无成熟的商品化LI抗体检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供一种胞内劳森菌flgE重组蛋白及胞内劳森菌抗体的检测试剂盒，以胞内劳森菌flgE重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法，可作为监测LI在猪群中的流行情况和评估感染的一种储备技术。

为达上述目的，本发明通过对LI全序列进行生物信息学分析，挑选LI所有的表面蛋白(共34个)进行克隆表达，根据各蛋白与LI阳性血清反应程度、LI阳性血清检出率及LI阴性血清本底低等初步试验，筛选得到一个较优蛋白flgE。胞内劳森菌flgE重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码胞内劳森菌flgE重组蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明的胞内劳森菌flgE重组蛋白的制备过程为：(1)构建包含有编码胞内劳森菌flgE重组蛋白的基因片段的重组表达质粒pET28a-flgE；(2)重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，诱导表达，纯化重组目的蛋白。

本发明还提供一种检测胞内劳森菌抗体的试剂盒及该试剂盒对临床血清的应用，所述试剂盒包括用上述胞内劳森菌flgE重组蛋白包被的EILSA板、稀释液、封闭液、洗涤液、酶标羊抗猪抗体、底物显色液及终止液。

本发明的有益效果：(1)本方法用重组的胞内劳森菌的优势抗原蛋白研究而成，可用于猪群LI感染状态的评估，便于指导该菌感染的保护防控；(2)该方法可用于感染康复猪群或隐性感染猪群的免疫保护水平评估(注：猪只感染LI康复后具有坚强的免疫保护力)；(3)本方法敏感性高，在猪只感染LI半个月即可检测到抗体，可用于早期发现猪群的感染，时间不晚于目前唯一得到公认的瑞典Savnova公司的抗体检测试剂盒；(4)用于评估猪群的感染，比从粪便中检测病原的优势明显；(5)本方法检测快速，3个小时即可获得检测结果，便于半个工作日(上午或下午)内的工作安排，可保证工作人员按时下班休息；(6)对阴性血清的检测假阳性低，本方法特异性高，特异性可高达92％。

附图说明

图1是本发明flgE重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达及蛋白纯化SDS-PAGE分析电泳图。