[发明专利]一种NDM-1单克隆抗体的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种NDM‑1单克隆抗体的制备方法及其应用，步骤为：合成肺炎克雷伯菌NDM‑1基因，表达纯化NDM‑1蛋白，以重组NDM‑1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS‑1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水，再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得7株NDM‑1蛋白单克隆抗体，并通过测序获得了其中4株单克隆抗体的氨基酸序列；为建立NDM‑1的检测方法奠定了基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种NDM-1单克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术

新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)是一种在2008年新被发现的金属酶(MBL)，因其首次在印度的新德里发现而得名，分离自一位瑞典的印度籍患者，携带菌株为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。随后，在全球范围内超过20个国家出现了NDM-1耐药菌的报道，越来越多的数据表明产NDM-1的耐药菌已经呈全球范围播散趋势，有可能成为威胁人类健康的巨大隐患，引发了全球性的恐慌。据报道，NDM-1在革兰阴性杆菌中广泛存在，主要分布于肠杆菌科和不动杆菌属中的细菌，现已经在肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属和变形杆菌属中发现NDM-1耐药细菌存在。研究表明，NDM-1是通过质粒介导的，转入细菌后可自由复制，在细菌之间传递，人员之间接触传播：同时携带这个基因的质粒通常整合了多种耐药基因如大环内酯类、氨基糖苷类、利福平、磺胺甲噁唑、单环β-内酰胺类，从而使细菌对多种抗生素产生耐药性。NDM-1酶共270个氨基酸，分子量约28kDa，氨基酸序列与目前已知的金属-β-内酰胺酶(MBL)相比，一致性不足33％，其不同之处在于活性位点旁有独特的氨基酸残基和插入序列，同时可以更紧密的结合碳青霉烯类抗生素。

NDM-1能水解几乎所有的β内酰胺类抗生素，其中包括目前最有效力的碳青霉烯类抗生素，给临床治疗和医院感染防控带来巨大的挑战。而现有的NDM-1检测方法特异性差、耗时长，延误患者的诊断和治疗；现有技术NDM-1蛋白的单克隆抗体，纯度效价低、特异性差。因此，建立一种灵敏、快速、特异性好的NDM-1检测诊断方法和制备纯度效价高、特异性强的NDM-1蛋白的单克隆抗体具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术的诸多缺陷，建立一种NDM-1单克隆抗体的制备方法及其应用，本发明制备了7株NDM-1单克隆抗体，制备的单克隆抗体纯度效价高、特异性强，具有重要的临床应用价值。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种NDM-1单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：合成肺炎克雷伯菌NDM-1基因，表达纯化NDM-1蛋白，以重组NDM-1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水，再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得NDM-1蛋白单克隆抗体，并通过测序获得单克隆抗体的氨基酸序列。

作为本发明的进一步说明，所述的NDM-1单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1)：NDM-1基因的合成

从GenBank序列数据库中获取肺炎克雷伯菌NDM-1基因的氨基酸序列；依据大肠杆菌的密码子偏好性进行NDM-1基因的碱基序列的密码子优化，并合成密码子优化后的基因序列；所述NDM-1基因的NCBI蛋白质数据库中的accession number为CAZ39946.1；

步骤2)：NDM-1基因的表达和纯化