[发明专利]一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种KPC‑2单克隆抗体及其制备方法和应用，其中KPC‑2单克隆抗体制备过程包括：合成肺炎克雷伯菌KPC‑2基因，表达纯化KPC‑2蛋白，以重组KPC‑2蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS‑1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水，再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得了KPC‑2蛋白单克隆抗体。本申请所获得的KPC‑2单克隆抗体均能与KPC‑2蛋白结合；且所得的KPC‑2单克隆抗体的效价在200万以上，且KPC‑2蛋白的单克隆抗体，纯度高、特异性强、灵敏度高，可用于制备用于检测KPC‑2基因诊断试剂。

技术领域

本发明涉及免疫治疗生物医药领域，具体涉及一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

KPC-2首先在肺炎克雷伯菌中被发现，产KPC-2型碳青霉烯酶菌株在世界各地均有报道，已发现其宿主菌包括肺炎克雷伯菌、产酸克雷菌、阴沟肠杆菌、沙门菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌，甚至铜绿假单胞菌，表明KPC型基因在不同种属甚至科间具有很强的传播能力。重视对碳青霉烯类耐药株的检测，防止产KPC酶株的爆发流行显得尤为重要，也是抗感染面临的新挑战。

而现有的KPC-2检测方法特异性差、耗时长，延误患者的诊断和治疗；现有技术KPC-2蛋白的单克隆抗体，纯度效价低、特异性差。因此，建立一种灵敏、快速、特异性好的KPC-2检测诊断方法和制备纯度效价高、特异性强的KPC-2蛋白的单克隆抗体具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术的诸多缺陷，提出一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用，本发明制备了6株KPC-2单克隆抗体，制备的单克隆抗体纯度效价高、特异性强，具有重要的临床应用价值。

本申请第一方面提供一种KPC-2单克隆抗体，包含1D7与4B2单克隆抗体，该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区；该单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为如下(1)～(2)：

(1)所述1D7单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述1D7单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

(2)所述4B2单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述4B2单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

本申请第二方面提供一种上述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：合成肺炎克雷伯菌KPC-2基因，表达纯化KPC-2蛋白，以重组KPC-2蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合，通过间接ELISA 法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得KPC-2蛋白单克隆抗体。

作为本申请的进一步说明，所述方法具体包括以下步骤：

步骤1)：KPC-2基因的合成

从GenBank序列数据库中获取肺炎克雷伯菌KPC-2基因的氨基酸序列；依据大肠杆菌的密码子偏好性进行KPC-2基因的碱基序列的密码子优化，并合成密码子优化后的基因序列；

步骤2)：KPC-2基因的表达和纯化

将KPC-2基因连接至pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达；收集菌体，高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex-200柱进行再次精细纯化，获得了纯度较高的KPC-2重组蛋白，收集KPC-2蛋白作为抗原备用；

步骤3)：小鼠的免疫