[发明专利]一株产表面活性素的大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开一株产表面活性素的大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用。本发明通过ExoCET重组技术，将双酶切获得的表面活性素合成基因簇和带有同源臂的载体片段，在体外经过T4DNA聚合酶退火后，转入带有重组系统的菌株中，完成重组，获得重组质粒pWG‑SRF。转入大肠杆菌野生型菌株，获得工程菌BW25113/pWG‑SRF。该工程菌株具有从头构建的更简洁的表面活性素合成代谢网络、更小的基因组和更短的发酵生长周期。此外，从该大肠杆菌菌株发酵液提取获得的表面活性素，具有较强的表面活性剂功能，有望在石油提取、日用化工、抗菌抗病毒制剂等领域被开发利用，具有良好的开发利用前景。

技术领域

本发明属于微生物代谢工程与合成生物学领域，具体涉及一种产表面活性素的大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用，特别涉及能够生产表面活性素的工程菌BW25113/pWG-SRF。

背景技术

表面活性素由7个氨基酸和一条β羟基脂肪酸链(C12-C16)缩合而成，是一种主要由芽孢杆菌属细菌合成的环状脂肽[1]。表面活性素具有极强的表面活性效能，被认为是目前已知的最强生物表面活性剂，并在石油、日化、杀菌等方面有很大应用价值。

大量过往研究采用培养基优化、反应器重设计、工农业废料发酵等方法以提升表面活性素合成水平，降低其原材料价格，但均未能取得长足的成效[2]。

现有大量研究表明，绝大部分芽孢杆菌属细菌中的表面活性素合成代谢相关基因还和生物膜、芽孢的形成等宏观生长繁殖性状关联[3]。在对暹罗芽孢杆菌JFL15的基因组测序研究中发现，表面活性素的合成速率会受到AbrB[4]、DegU[5]、CodY[6]等全局调控子的调节，并总体被控制在较低范围，以此与细菌其他生长状况相协调[7]。同时，表面活性素的合成还会受到ComXQPA等与芽孢形成相关联的群体感应系统的调控[8]。

芽孢杆菌属细菌在发酵合成表面活性素时，还会同时合成伊枯草菌素(iturin)和芬荠素(fengycin)等多种环状脂肽和线性脂肽。其中，三类环状脂肽结构相近，分离难度较大，推高了单组分表面活性素的生产成本。据Coutte等报道，目前市售脂肽类抗菌肽化合物的分离纯化成本占总生产成本的60％以上[9]。对暹罗芽孢杆菌进行抗菌物质分离，鉴定出3大类抗菌脂肽类化合物、嗜铁素类化合物、聚酮类化合物、环二肽类化合物等多种抗菌物质，与过往报道的芽孢杆菌属细菌所产抗菌脂肽种类的复杂性是一致的[10]。对此，周泽宇等在解淀粉芽孢杆菌NK-△LP菌株中敲除了2种结构类似物伊枯草菌素和丰原素的合成基因，但也未能完全阻止除表面活性素外的所有种类抗菌脂肽的合成[11]，提示要构建产单组分表面活性素的芽孢杆菌属工程菌是较为困难的。

在芽孢杆菌属中，表面活性素由多功能酶系(nonribosomal peptide synthase,NRPS)合成。合成表面活性素的基因簇为srf操纵子，其全长26kb[1]。

张友明等报道，ExoCET重组技术将体外DNA重组和体内RecET同源重组相结合用于大片段生物合成基因簇的直接克隆。将大小在106kb以内的DNA片段直接捕获到表达载体[12]。利用上述重组系统，张友明等成功在大肠杆菌中表达了10种NRPS途径，其中3种成功检测到产物[12]。因此，成功构建产单组分表面活性素的工程菌是具有重要意义的。

参考文献：

1.郅岩.芽孢杆菌高效合成表面活性素的代谢机制及功能研究[D].江南大学,2017.

2.Hamoen LW，Venema G，Kuipers OP.Controlling competence in Bacillussubtilis:shared use of regulators[J].Microbiology,2003.149(1):9-17.