[发明专利]一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒

说明书

本发明公开一种基于荧光PCR技术鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒，所述引物和荧光探针包括基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的引物WF、引物WR和荧光探针W以及基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的引物ZF、引物ZR和荧光探针Z，所述试剂盒包括荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阴性对照和阳性对照，所述荧光PCR反应液包括上述引物和荧光探针；鲟鱼基因组样品在进行荧光PCR扩增后，进行Ct值分析；若两组引物的荧光PCR结果均为阳性，则待测样品为雌性；若W染色体特异DNA序列引物的荧光PCR结果为阴性而Z染色体特异DNA序列引物的荧光PCR结果为阳性时待测样品为雄性；本发明的鉴定方法实现在鲟鱼生命早期阶段进行性别鉴定，操作简便、结果准确、适用于生产实践。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及生物的分子检测，具体地涉及一种基于荧光PCR鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒。

背景技术

鲟鱼包括鲟属Acipenser和鳇属Huso，是软骨硬鳞下纲中现存唯一的目，素有“活化石”之称，鲟鱼籽酱被誉为“黑色黄金”。我国是最大的鲟鱼养殖国和主要的鲟鱼籽酱出口国，2019年中国鲟鱼子酱出口数量为139.8吨，出口金额为3253.5万美元。然而，鲟鱼生长周期长，性成熟慢，且无明显副性征，在发育早期很难从外观上区分雌雄，通常要在养殖3～4年后才能辨出雌雄，之后将雄鱼淘汰作为商品鱼上市；雌鱼养殖需要持续养殖至7～8年用于鱼籽酱生产，在目前鲟鱼养殖的市场上，不能够依照雌雄性别分别进行集约化养殖或一定性别比例进行饲养，会造成饲养过多雄性个体的资源浪费，增加了养殖成本，阻碍了鲟鱼养殖产业化的快速发展，因此，及早准确的判断鲟鱼的性别，可以减少对雄鱼的饲料投入，节约养殖成本，在生产中就显得十分重要。

在生产实践中，关于鲟鱼性别鉴定的主要方法有：(1)超声波法，(2)腹腔外侧手术法，(3)腹腔穿刺法，上述方法都需要鲟鱼性腺发育到一定阶段(3～4年鱼龄)才能鉴定，且在鉴定过程中存在鱼体脱水时间久、操作复杂、鉴定时间长等问题，容易对鱼体造成伤害。近年来，随着分子生物学的高速发展，利用分子鉴定性别的技术日趋流行，相较于传统的鉴定方法，分子鉴定方法采样方便、对生物损伤小、操作简便、结果更准确。已有研究表明鲟鱼为雌雄异体，遗传性别决定系统为ZZ/ZW型，雄性鲟鱼为ZZ，雌性鲟鱼为ZW，因此，利用分子检测方法可以实现在鲟鱼生命早期阶段进行雌雄性别鉴定。现有技术中，专利号为CN201910066586.4的中国专利公开了用于鲟鱼性别鉴定的雌性特异性DNA片段SSM2及应用，专利号为CN201910066600.0的中国专利公开了用于鲟鱼性别鉴定的雌性特异性DNA片段SSM1及应用，专利号CN201910066534.7的中国专利公开了用于雌性施氏鲟特异DNA片段及应用，上述专利提供了一些关于鲟鱼的特异性分子标记片段和引物，可用于鉴定鲟鱼的性别，但是上述专利中公开的片段仅为雌性W染色体上的特异DNA片段，设计的引物仅能扩增出一条带，一旦提取的DNA质量不好、PCR或凝胶电泳操作失误就会导致电泳图不出现条带，而将样本错判为雄性，出现假阴性的情况；此外，现有鲟鱼性别的分子鉴定方法均基于普通PCR扩增并将产物进行凝胶电泳的方式，这种方法检测的样品量受限于凝胶试样格(一般为二三十个梳孔)，在成本和效率上并不适用于生产上大规模的鲟鱼雌雄鉴别工作。

在鲟鱼性别分子鉴定方法中，性别特异性DNA标记是进行性别判断的重要工具；如果可以根据W染色体上的特异DNA片段和Z染色体上的特异DNA片段设计两对特异性引物对鲟鱼基因组进行PCR扩增，雌性(ZW)会出现两个阳性结果，而雄性(ZZ)鲟出现一个阳性结果，这样通过双阳性的结果来判断雌雄，就可以排除假阴性的可能，使结果更加可靠准确。