[发明专利]单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法及其应用

权利要求书

1.一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：分别提取单增李斯特菌标准品、待测样品和非目标菌株的DNA，然后将得到的DNA进行微滴数字PCR扩增得到反应液，最后对反应液进行检测和分析；

所述微滴数字PCR扩增的引物具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述微滴数字PCR扩增的探针具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述单增李斯特菌标准品包括质粒；

优选地，所述质粒包括单增李斯特菌被所述引物所扩增的序列。

3.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述非目标菌株包括金黄色葡萄球菌、铜绿芽孢杆菌、沙门氏菌或大肠杆菌中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述微滴数字PCR的反应体系包括：ddPCR Supermix for Probes 9-11μL、上游引物1.8-2.2μL、下游引物1.8-2.2μL、探针0.9-1.1μL、模板DNA 0.9-1.1μL和双蒸水3.6-4.4μL；

优选地，所述微滴数字PCR的反应体系包括：ddPCR Supermix for Probes 10μL、上游引物2μL、下游引物2μL、探针1μL、模板DNA 1μL和双蒸水4μL。

5.根据权利要求4所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系中，上游引物、下游引物和探针的浓度各自独立地为90-110μmol/L，优选为100μmol/L。

6.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述微滴数字PCR的反应条件为：预变性：94-95℃，3-10min，1个循环；变性：94-95℃，30-40s，退火：50-58℃，60-80s，40个循环；结束反应：4-6℃，4-6min，88-90℃，4-6min，1个循环；控温速率1.9-2.1℃/s；

优选地，所述微滴数字PCR的反应条件为：预变性：95℃，5min，1个循环；变性：95℃，30s，退火：55.7℃，60s，40个循环；结束反应：4℃，5min，90℃，5min，1个循环；控温速率2℃/s。

7.根据权利要求1所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述探针的两端分别含有荧光淬灭基团和荧光报告基团。

8.根据权利要求7所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、CY5或HEX，优选为FAM。

9.根据权利要求7所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于，所述荧光报告基团包括BHQ1或BHQ2，优选为BHQ1。

10.权利要求1-9任一项所述的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法在食品检测中的应用。