[发明专利]一种提高谷氨酸棒杆菌合成L-谷氨酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高谷氨酸棒杆菌合成L‑谷氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明成功实现了敲除转录调控因子Ncgl1124和过量表达转录调控因子Ncgl1124的重组谷氨酸棒杆菌的构建。通过纯化出蛋白Ncgl1124，通过体外EMSA试验验证了转录调控因子Ncgl1124能够与启动子P_GlnA结合。通过5‑L发酵罐流加发酵培养，重组谷氨酸棒杆菌G01/p19‑Ncgl1124的L‑谷氨酸产量相对于对照菌株谷氨酸棒杆菌G01提高了22％，产量达到了165.3g/L；谷氨酰胺水平为1.6g/L，下降了90％。说明本发明公开的转录调控因子Ncgl1124能够通过与启动子P_GlnA结合，进而抑制谷氨酸向谷氨酰胺的分解途径，从而提高L‑谷氨酸的含量。

技术领域

本发明涉及一种提高谷氨酸棒杆菌合成L-谷氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-谷氨酸在氨基酸市场中作为风味添加剂被广泛使用，具有巨大的市场规模，年产量约为250万吨。L-谷氨酸主要用于生产味精、香料，以及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等，同时，L-谷氨酸本身可用作药物，参与脑内蛋白质和糖的代谢，促进氧化过程，该品在体内与氨结合成无毒的谷酰胺，使血氨下降，减轻肝昏迷症状。

谷氨酸棒杆菌最开始作为一株L-谷氨酸生产菌株而被分离，后面为了适应其他氨基酸的生产，逐渐通过代谢改造，用来实现精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸等氨基酸的生产，并获得了显著的成果。转录调控因子是能够与特定DNA序列进行结合的蛋白质，通常位于靶基因的5’端上游区域，以调节基因转录的速率，能够增强或者抑制靶基因的表达，在细胞的代谢过程中发挥着重要的作用。传统的谷氨酸棒杆菌高产菌株的选育主要从代谢工程改造、发酵条件优化、诱变育种、氨基酸转运蛋白的研究，很少有研究关注转录调控因子在高产菌株选育过程中发挥的重要作用。尤其是在发酵生产L-谷氨酸过程中，几乎没有关注过转录调控因子在L-谷氨酸发酵过程中所参与的相关调控作用。

发明内容

鉴于目前L-谷氨酸生产代谢网络的研究还不够透彻，不能很好地解决L-谷氨酸生产的问题，本发明提出了利用转录调控因子Ncl1124来调节L-谷氨酸的合成代谢，并促进L-谷氨酸的积累。启动子P_GlnA是谷氨酰胺合成酶(GlnA)的启动子，能够启动GlnA的转录。GlnA能够将L-谷氨酸转为谷氨酰胺，进而削弱L-谷氨酸的积累。转录调控因子Ncgl1124对于L-谷氨酸的积累是一个正向的转录调控因子，Ncgl1124能够与启动子P_GlnA结合，进而抑制了下游基因L-谷氨酸合成酶的表达，从而抑制了L-谷氨酸的分解代谢，促进了L-谷氨酸的积累。

本发明提供了一种重组菌，所述重组菌过表达谷氨酸棒杆菌来源的转录调控因子Ncgl1124，所述谷氨酸棒杆菌来源的转录调控因子Ncgl1124的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在一种实施方式中，所述重组菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌G01。

在一种实施方式中，将编码所述转录调控因子Ncgl1124的核苷酸连接至表达载体构建得到重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞中，构建得到重组菌。

在一种实施方式中，编码所述转录调控因子Ncgl1124的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在一种实施方式中，所述表达载体为pXMJ19。

本发明提供了一种生产L-谷氨酸的方法，利用所述重组菌以葡萄糖为底物生产L-谷氨酸。

在一种实施方式中，反应体系中含有三水合磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、玉米浆、七水合硫酸亚铁、一水合硫酸锰和尿素。

在一种实施方式中，将OD₆₀₀约7-11的重组菌以1-10％的量加入反应体系中，在25-35℃，150-250rpm，pH为6.5-7.5下反应。