[发明专利]用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途

说明书

本发明公开一种用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途。本发明的试剂盒包含能够以混合物形式存在的通用引物，其中该通用引物能够结合至米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌的共有基因保守区。本发明的试剂盒可实现对多种毛霉真菌的一次性检测，检测时间不超过2小时，还能进一步在一次检测中确定毛霉的具体类型。

技术领域

本发明涉及真菌检测领域，具体地涉及用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途。

背景技术

毛霉菌病是一种罕见且病死率极高(可达50％以上)的侵袭性真菌感染，疾病的特征是血管侵犯和随后的血栓形成引起的组织坏死。毛霉菌病多发于存在明显危险因素或诱发因素的人群，包括器官移植、恶性血液病、糖尿病或肾功能衰竭患者，常为基础疾病所掩盖，所以临床误诊、漏诊率较高。毛霉菌病进展迅速，控制原发病、抗真菌治疗及外科手术清除局部病灶成为降低病死率的关键。

由于缺乏实验室检查支持，仅凭临床经验难以做出诊断。近年来开展的真菌抗原检测如血清1-3-β-D葡聚糖抗原(G试验)在毛霉感染时阴性。因此，毛霉感染只有通过真菌学和病理学组织学检查才能确诊。一旦在病灶刮片或培养中找到接合菌，或者在组织切片中发现侵入血管壁的菌丝即可确诊。呼吸道分泌物或异常组织涂片检查结果不很可靠，痰培养往往阴性，血培养的阳性率比痰培养更低。文献报道，痰培养阳性患者中，最后经纤支镜活检证实为肺毛霉感染者仅为50％，由开胸活检证实者仅为32％。由此可见，痰培养可导致假阳性，因此在临床标本中检出毛霉时通常被视为污染菌。对那些无法确诊的患者常需采用创伤性检查来明确诊断，如经支气管镜肺活检、经皮肺穿刺活检或开胸肺活检。

在诊断领域，已公开了多种针对真菌的检测。例如，CN 109706145 A公开了一种用于毛霉目的4种真菌LAMP引物组合及其应用。可应用于检测是否含有稻根霉菌、伞状毛霉菌、卷枝毛霉菌和/或微小根毛霉，可应用于检测待测样本中是否含有稻根霉菌、伞状毛霉菌、卷枝毛霉菌和/或微小根毛霉。虽然该引物组合具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测，但是该方法使用多对引物，引物并没有通用性。

发明内容

针对现有技术中的至少部分技术问题，发明人在深入研究后发现在能够引发肺毛霉菌病的众多真菌中存在一组特定的真菌组合，即米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌，它们虽然属于不同的种属，但是却存在特定的保守区。由此发明人设计了一组能够在一次同时检出多种真菌的引物。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒，其包含能够以混合物形式存在的通用引物，其中，所述通用引物能够结合至米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌的共有基因保守区。

根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，所述通用引物的序列如SEQ ID NO:1-4所示。

根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，进一步包含特异性探针组，其序列如SEQ ID NO:5-9所示。

根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，进一步包含用于构建反应液的缓冲液，其中，所述反应液为扩增反应的体系，其包含8-20mM Tris-HCl、40-60mMKCl、0.05-0.5％乙基苯基聚乙二醇和2-8mM MgSO₄，且pH值为8.5-9.0。

根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，进一步包含内部质控和阳性质控。

根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，进一步包含热启聚合酶。

本发明的第二方面，提供试剂盒的使用方法，其包括使用所述通用引物和可选的特异性探针组构建反应体系的步骤，和对所述反应体系进行PCR扩增的步骤。