[发明专利]一种沙林模拟剂半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法

说明书

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种沙林模拟剂甲基膦酸二甲酯半抗原、人工抗原和抗体的制备方法。本发明的甲基膦酸二甲酯半抗原结构简单，易合成，同时对环境友好。甲基膦酸二甲酯人工抗原以牛血清白蛋白和卵清蛋白作为载体蛋白，合成的人工抗原偶联比值大，具有很好的免疫活性；且人工抗原中保留了膦酸酯基团，有利于制备出高质量抗体。以合成的人工抗原通过动物免疫获得人工甲基膦酸二甲酯多克隆抗体，本发明制备的抗体效价高、特异性强；可用于开发甲基膦酸二甲酯免疫快速分析技术、方法和产品。

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及沙林模拟剂甲基膦酸二甲酯半抗原、人工抗原和抗体的制备方法。

背景技术

近几年，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测小分子量物质由于其操作简便、灵敏性高、特异性强以及快速准确的优点备受关注，在农药残留检测方面的应用发展迅速。甲胺磷、甲基对硫磷、菊酯类农药、氟虫腈杀虫剂、除虫脲农药等的ELISA分析方法都有大量报道。随着生物技术、传感器技术的迅猛发展，ELISA方法在生防菌监测、除草剂残留检测、农药残留(水和土壤)检测以及环境致病菌监测中得到了广泛的应用。

甲基膦酸二甲酯(Dimethyl methylphosphonate，DMMP)是一种有机膦酸酯神经毒剂，具有与剧毒化学品沙林类似的分子结构。由于DMMP毒性远低于沙林，经常被用来当作沙林的模拟试剂。传统检测DMMP的方法是气相色谱，灵敏度高并且选择性好，但存在设备昂贵笨重，样品前期处理过程繁琐，受限于实验室条件检测等缺点。便携的检测DMMP方法多采用表面声波(SAW)传感器、石英晶体微天平(QCM)传感器、半导体传感器等，但亦面临特异性差、抗环境干扰能力差、检出灵敏度较低的问题。

发明内容

基于此，本发明的目的是基于ELISA方法，提供一种沙林模拟剂甲基膦酸二甲酯(DMMP)半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法。应用该方法制备的抗体可进一步用于开发DMMP免疫快速分析技术、方法和产品。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种以DMMP为骨架的人工半抗原，其分子结构为：

H1:R₁＝—(CH₂)₂COOH (Ⅰ)

或

H2：R₂＝—NH—(CH₂)₅COOH (Ⅱ)

一种甲基膦酸二甲酯半抗原的制备方法，制备上述的甲基膦酸二甲酯半抗原，其方法具体如下：

S1、将羧基化合物和氢氧化钾溶于无水甲醇中，然后逐滴加入氯磷酸二甲酯，滴加完毕后，搅拌加热，反应10-15h；

S2、反应结束后，先减压蒸馏，除去甲醇，接着用乙酸乙酯将残留物溶解，再加入氢氧化钠溶液，最后用盐酸调节反应液pH值至1-4；

S3、调完pH值后，用乙酸乙酯萃取多次并合并有机层，再用水洗涤，最后加入无水硫酸镁干燥过夜，过滤，减压蒸馏除去乙酸乙酯，获得目标产物；

S4、将步骤S3中目标产物用柱层析法进行提纯，其中所用的洗脱液为氯仿、乙酸乙酯、乙酸混合物。

进一步的，羧基化合物为对羟基苯丙酸、6-氨基己酸中任意一种。

进一步的，洗脱液中氯仿、乙酸乙酯、乙酸的摩尔比为25-40:1-10:1

本发明提供一种以上述合成的半抗原与载体蛋白偶联制备的人工抗原及其制备方法，所述人工抗原是由载体蛋白和所述的甲基膦酸二甲酯半抗原进行偶联反应得到。

所述人工抗原的结构为：