[发明专利]一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法

权利要求书

1.一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于，以17α-羟基黄体酮为底物，利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮，包括如下步骤：

步骤1)：配制培养基；

步骤2)：在培养基中培养赭曲霉；

步骤3)：羟化酶诱导；

步骤4)：制备固定化羟化酶；

步骤5)：配制转化体系；

步骤6)：底物转化；

步骤7)：产物提取精制；

其中，所述步骤4)具体为：将步骤3)获得的菌体重悬于无菌水中，菌体与水的比例为(0.5-1)g:1mL，搅拌均匀后，用高速均质机对菌悬液进行细胞破碎，然后过滤，获得的上清液即为羟化酶粗酶液，继续向羟化酶粗酶液中加入包埋剂，混合均匀后，再滴入质量浓度0.6％的氯化钙饱和硼砂溶液中，搅拌固定1.0-3.0h，过滤，获得固定化羟化酶；所述的包埋剂为海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液，海藻酸钠、聚乙烯醇的质量浓度分别为30-50g/L、80-120g/L，海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液与羟化酶粗酶液的体积比为1:1；

所述步骤6)具体为：将步骤4)获得的固定化羟化酶加入到步骤5)获得的转化体系中，固定化羟化酶与转化体系的比例为1g:(100-200)mL，控制反应温度25-30℃，转速180-250r/min，转化时间12-24h。

2.如权利要求1所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述步骤1)包括一级和二级培养基的配制，所述一级培养基包括以重量份数计的葡萄糖5-10份，酵母膏2-8份，K₂HPO₄ 1.0-2.0份，NaCl 0.1-1.0份，水1000份，并调节pH至5.0-6.8；所述二级培养基包括以重量份数计的蔗糖20.0-40.0份，酵母膏10.0-30.0份，玉米浆20.0-40.0份，K₂HPO₄ 1.0-2.0份，MgSO₄·7H₂O 1.0-3.0份，水1000份，并调节pH至5.0-6.8。

3.如权利要求2所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述步骤2)包括一级发酵和二级发酵，先将赭曲霉的斜面菌种接种于一级培养基中，培养12-36h，后再按照体积分数为10％的接种量将一级发酵液接入二级培养基中，发酵时间12-24h，得二级培养液；所述赭曲霉的培养条件为温度25-30℃，培养时控制摇床转速180-250rpm。

4.如权利要求1或3所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述步骤2)中的赭曲霉，拉丁文名为Aspergillus ochraceus，保藏号为CCTCCNO:M 2019186，保藏日期为2019年3月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。

5.如权利要求3所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：在步骤2)所得的二级培养液中加入质量浓度为0.1-1.0g/L的17α-羟基黄体酮，继续培养6-12h后，停止发酵，过滤取菌体，并用质量浓度0.9％的生理盐水反复清洗菌体3次。

6.如权利要求1所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述高速均质机的转速为1.0×10⁴-2.0×10⁴r/min，处理时间为15-25min，均质过程中用低温循环器控制体系温度为4-10℃。