[发明专利]PLGA-PEG-Poly I：C纳米颗粒的制备及其在结核亚单位疫苗中的应用

说明书

本发明公开了PLGA‑PEG‑PolyI：C纳米颗粒的制备方法，先用化学合成的方法使PLGA和NHsubgt;2/subgt;‑PEG形成PLGA‑PEG共聚物，然后用复乳溶剂挥发法(W/O/W)将本实验构建的两个结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6‑Rv2626c和Mtb10.4‑HspX(简称为M4)包裹在纳米颗粒中，进而应用聚多巴胺和PolyI:C进行修饰，形成包裹结核分枝杆菌融合蛋白M4的PLGA‑PEG‑PolyI：C(简称为NP)纳米颗粒结核亚单位疫苗NP/M4。采用本发明所提供的纳米颗粒结核亚单位疫苗免疫小鼠后，NP/M4组在HspX蛋白、Rv2626c蛋白刺激后，脾脏淋巴细胞分泌IFN‑γ和IL‑2的水平明显高于PBS组和BCG组，表明NP/M4组可产生较高水平的IFN‑γ和IL‑2；此外，NP/M4组HpsX和Rv2626c特异性IgG和sIgA抗体水平明显高于PBS、BCG和融合蛋白M4组。PLGA‑PEG‑PolyI：C纳米颗粒可辅助抗原诱导细胞免疫和体液免疫，是结核亚单位疫苗理想的佐剂。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是应用化学修饰构建纳米颗粒佐剂，构建新型疫苗。

背景技术

结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一，全世界仍有近1/3的人感染过结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，Mtb)^[1]，有的结核感染者在大约2-5年内会发展为肺结核病人，其余的有可能会形成结核病的潜伏感染者。我国是结核病高负担的国家之一，每年约有13万人因结核病而死亡。

目前，卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)的接种是有效预防结核病的重要措施。然而，不同研究显示，BCG在不同人群中的保护性不稳定，尤其是对成人肺结核的保护效价于0-80％不等。因此，研制和开发全面高效的抗结核疫苗是控制结核病的重要途径。目前抗结核的免疫保护机制尚不清楚^[2]，一般认为抗原特异性的CD4⁺Th1细胞和CD8⁺T细胞在预防Mtb感染中起着重要的作用。Th1型细胞因子如IFN-γ和IL-2是目前评估免疫保护性的重要指标^[3]。毫无疑问，T细胞介导的免疫反应对于消除Mtb的感染至关重要。此外，抗原特异性抗体最近也受到越来越多的关注^[4]。Busch M等研究表明，IgA可以在体外阻止Mtb对细胞的入侵^[5]。Kozakiewicz L等也发现B细胞耗尽导致感染Mtb的非人类灵长类动物Mtb载量增加^[6]。因此，有效的疫苗应同时激发细胞免疫和体液免疫。

目前可供研究的结核疫苗形式有：亚单位疫苗，重组BCG疫苗，减毒活疫苗等。亚单位疫苗又包括蛋白疫苗、DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗，其中蛋白疫苗具有成分明确，使用安全等优点，易于被人们接受^[7]。联合佐剂的蛋白亚单位疫苗具有广阔的应用前景。然而，目前临床常用的佐剂为铝佐剂，该佐剂主要诱导Th2型体液免疫反应^[8]。为了提高结核疫苗的保护效应，研究新型的可以诱导Th1型细胞免疫的佐剂至关重要。目前，一些新的可诱导细胞免疫的脂质体佐剂AS01和CAF01已进入临床试验阶段。CAF01的核心成分是阳离子脂质体二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium，DDA)，阳离子脂质体不仅可提高抗原提呈效率，保护抗原在体内不被降解，还可以诱导树突状细胞的成熟，从而增强免疫效应^[9]。

我们实验室之前制备了由DDA和Poly I:C组成的DP佐剂，经动物实验证实其具有良好的佐剂激活以及保护效应^[10]。大量研究表明，粘膜接种疫苗对结核病有预防作用^[11,^12]。然而，由于DDA难以用于粘膜免疫^[13,14]，故迫切需要开发生物安全性高的佐剂来刺激粘膜免疫应答。