[发明专利]马传染性贫血病毒荧光PCR检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)荧光PCR检测试剂盒及其应用。所述的检测试剂盒中含有用于特异性检测马传染性贫血病毒的引物和探针。相较于现有的检测方法，使用本发明的试剂盒能够检测到更多的EIAV毒株，具有广谱性的特点，而使用OIE推荐的引物探针组合仅能检测到美洲毒株EIAVUK3及其序列相似的毒株。并且本发明的试剂盒灵敏度高、特异性好，检测毒株范围广。本发明的提出为马传染性贫血病毒的检测提供了一种更为有效的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种PCR检测试剂盒及其应用，特别涉及一种马传染性贫血病毒荧光PCR检测试剂盒及其应用。本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是反录病毒科(Retroviridae)慢病毒属的成员，可引起马、骡、驴的传染性贫血病，以发热、贫血、出血、黄疸、浮肿、心机能紊乱、血相变化和进行性消瘦为特征。根据临诊表现，常分为急性、亚急性、慢性和隐性4种病型，除有主要症状如发烧、贫血、黄疸、出血、心机能紊乱外，血液学的变化也很突出，如红细胞数减少、血红蛋白量降低、白细胞数常减少和静脉血中出现吞铁细胞等。该病呈世界分布，给养马业造成巨大经济损失。此外也曾有几例人感染此病毒的报道。发烧期的病马是最危险的传染源，其血液和脏器(肝、脾、骨髓、淋巴结等)含有大量病毒，常随同分泌物和排泄物排出体外而散播。慢性病马能长期甚至终身带毒。目前，针对EIAV抗原检测的方法主要有PCR方法、ELISA方法以及传统的病毒分离鉴定等。病毒分离耗时费力，ELISA方法重复性不好，且受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，相比之下，PCR方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。包括EIAV在内的各种慢病毒基因组存在高度变异的特征，不同毒株间基因组存在较大差异，难以建立通用型的定量PCR检测方法。gag基因是慢病毒基因组中相对保守的基因序列，所以通常将gag基因最为主要的检测靶标。世界动物卫生组织(OIE)推荐的马传贫荧光定量PCR的检测方法就是针对gag基因设计的，但是该方法仅能检测到美洲毒株EIAV UK3及其序列相似的毒株。近年来，一些亚洲学者均报道了该方法无法检测到其本国毒株的情况，包括我国的毒株采用OIE推荐的方法也是检测不到的。因此，急需建立一种通用的、广谱的马传染性贫血病毒PCR核酸检测方法。

马传染性贫血病毒属反转录病毒科慢病毒属成员，类似于其他反转录病毒，EIAV感染早期在病毒反转录酶的作用下形成双链病毒DNA(通常称为前病毒DNA，proviralDNA)，前病毒DNA在病毒编码的整合酶的作用下进一步整合到宿主染色体。所以，包括EIAV在内的反转录病毒虽然是RNA病毒，其基因组存在RNA和DNA两种形式。病毒虽然大量的存在于发热动物的血液和脏器中，但从血液中提取病毒需要高速离心(371000×g)2小时，耗时费力；脏器一般也不易采集，根据我国消灭马传贫的计划，阳性动物会被点击捕杀、深埋，严禁解剖。所以，国内外学者主要采用从外周血单核细胞中检测马传染性贫血病毒的基因组DNA。

发明内容

本发明的目的在于建立一种通用的、广谱的马传染性贫血荧光PCR检测方法，以及用于该检测方法的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种马传染性贫血病毒荧光PCR检测试剂盒，所述的检测试剂盒中含有用于特异性检测马传染性贫血病毒的引物和探针，其中所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的引物的序列如下所示：

上游特异性引物：5’AGACCCTRCCTGYTGAACCTGGCT 3’

下游特异性引物：5’YYCCATYTTACCTGTCMYCYTGTG 3’

所述的探针序列如下所示：

5’AAGACKTCTGTAAGTTCTCCTCTGCTG 3’