[发明专利]一种以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法

权利要求书

1.一种以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法，其特征在于，包括：以结核分枝杆菌弱毒株CMCC93020（H37Ra）为菌种，经扩增、灭活后，得到含代谢蛋白的菌液；将菌液盐析沉淀、酸变性沉淀、脱盐超滤及除菌过滤，得到蛋白原液；将蛋白原液检验、稀释及分装，得到结核菌素纯蛋白衍生物成品；

在所述扩增中，先在全植物源固体培养基中进行扩增，再在半固体培养基中进行扩增；

所述全植物源固体培养基为苏通土豆汤固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL、土豆汤940mL及琼脂粉20g；

所述半固体培养基为土豆苏通半固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL及注射用水940mL；分装500mL三角瓶，180mL瓶，每瓶放土豆块；

在所述沉淀中，灭活后的菌液先采用硫酸铵盐析沉淀，再进行三氯乙酸酸变性沉淀沉淀；其中，硫酸铵盐析沉淀2次，硫酸铵盐析沉淀终饱和度为40%，硫酸铵盐析沉淀2-4h；三氯乙酸酸变性沉淀沉淀4次，三氯乙酸酸变性沉淀沉淀浓度为3-4%，三氯乙酸酸变性沉淀沉淀1-2h。

2.根据权利要求1所述的以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法，其特征在于，在所述酸变性沉淀中，采用三氯乙酸湿法洗菌液中杂质多糖。

3.根据权利要求1所述的以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法，其特征在于，在所述脱盐超滤中，采用截留分子量为3KD的超滤设备。

4.根据权利要求1或3所述的以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法，其特征在于，在所述除菌过滤中，采用孔径为0.2μm的除菌过滤设备。

5.根据权利要求1所述的以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法，其特征在于，在所述稀释中，采用pH7.2-7.4、0.01mol/L 的PBS溶液，PBS溶液包括0.0005%的聚山梨酯-80。