[发明专利]慢病毒贴壁细胞培养工艺

说明书

本发明公开了一种慢病毒贴壁细胞培养工艺，其包括以下步骤：S1将HEK293T细胞在装有VP‑SFM培养基和低浓度的胎牛血清的培养装置中进行适应性驯化培养；S2步骤S1驯化培养良好的HEK293T细胞建立细胞库；S3将对数生长期的HEK293T细胞接种至细胞工厂；S4在四质粒系统中，对HEK293T细胞进行转染；S5转染50～100h后，收获细胞培养上清液，即可获得细胞活力达85%以上、转染上清滴度5×10⁶ TU/mL以上的慢病毒细胞。本发明的慢病毒贴壁细胞培养工艺，采用了低浓度的胎牛血清，降低了生产成本；使用PEIpro法转染，不仅简化操作流程；在细胞转染前后无需更换培养基，极大的简化了操作，且降低了细胞被污染的风险，这对于GMP生产来说具有极大的优势；降低了生产设备投入的成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及慢病毒贴壁细胞培养工艺。

背景技术

慢病毒常用于嵌合抗原受体-T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)，其具有转导效率高、可整合T细胞基因组并持续表达目标蛋白等优势。现如今，CAR-T生产大多基于慢病毒载体介导的CAR基因转移。

当前，用于生产慢病毒的工艺大多基于依赖胎牛血清(FBS)的贴壁细胞培养工艺（如HEK293T），其具体工艺为：在培养箱中，使用DMEM高糖培养基（gibco）+10%胎牛血清对HEK293T细胞进行驯化培养，对培养的细胞进行换液处理，然后使用转染试剂进行转染，转染时通常采用磷酸钙法、脂质体法(如Thermo公司的Lipofectamine2000)或聚乙烯亚胺法，转染完成后，再次对细胞进行换液处理。现有的生产慢病毒的贴壁细胞培养工艺的缺点在于，现有技术中采用10%浓度的胎牛血清，高浓度的胎牛血清FBS意味着高成本；而且由于胎牛血清(FBS)存在着批次及产地差异，高浓度依赖的FBS意味着产品存在批间差异的风险更高，因而会影响产品的质量稳定形；其次，转染前和转染后需要对培养的细胞进行换液处理，以提高转染效率和降低转染后的细胞毒性，这不仅增加了操作的复杂性，也增加了污染的风险，这对于药品的放大生产提出了更大挑战。此外，贴壁细胞转染用到的转染试剂通常为磷酸钙法、脂质体法(如Thermo公司的Lipofectamine2000)或聚乙烯亚胺法(如PEI或PEImax)，磷酸钙和PEI或PEImax通常需要自行配制，增加了质量检测通过的时间，转染试剂中的脂质体没有药品生产质量管理规范（GMP）的许可，因而后续的应用比较困难。

另一种慢病毒的细胞培养工艺为悬浮细胞培养工艺，慢病毒可以在不依赖于胎牛血清(FBS)的化学成分明确的培养基(CD media)中高密度生长，其优点是易于放大生产，尤其对于50 L、200L和1000 L规模的需求有更大的优势，但其滴度通常没有贴壁细胞工艺高，且硬件设备的投入（细胞培养摇床、生物反应器、生化检测仪等）通常较昂贵，下游纯化工艺通常要用到深层过滤，所使用的膜材质成本也更高，慢病毒的回收率通常也不如贴壁细胞高，因而通常只有少数几个公司开发出了成熟的工艺。

发明内容

本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的慢病毒贴壁细胞培养工艺，成本高，批次差异大，转染前后需要换液，操作复杂，且增加了细胞污染的风险，转染试剂质检困难等问题，提供一种能够解决前述问题的慢病毒贴壁细胞培养工艺。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：慢病毒贴壁细胞培养工艺，其特点是：其包括以下步骤：

S1将HEK293T细胞在装有VP-SFM培养基和低浓度的胎牛血清的培养装置中进行适应性驯化培养；

S2步骤S1驯化培养良好的HEK293T细胞建立细胞库；

S3将对数生长期的HEK293T细胞接种至细胞工厂；

S4 在四质粒系统中，对HEK293T细胞进行转染；

S5转染50～100h后，收获细胞培养上清液，即可获得细胞活力达90%以上、转染上清滴度5×10⁶ TU/mL以上的慢病毒细胞。