[发明专利]m5c修饰调节基因组在制备肿瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用

说明书

本发明涉及医学生物检测技术领域，提供了m5c修饰调节基因组在制备肿瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用，其中，肿瘤为肺腺癌，该基因组包括NSUN2、NSUN5、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET2和ALYREF；进一步提供了预后评估试剂盒，由逆转录系统、引物系统和扩增系统组成；还提供了一种预后评估系统，包括预后评估试剂盒以及安装在终端载体上的m5c‑score模型，m5c‑score模型包括PCA分析模块、打分提取模块以及m5c‑score计算模块，PCA分析模块基于上述基因的表达量对每个基因进行分析；打分提取模块提取每个基因的PC1和PC2打分；m5c‑score计算模块计算样本的m5c‑score。

技术领域

本发明属于医学生物检测技术领域，涉及m5c修饰调节基因组在肿瘤预后评估中的应用。

背景技术

真核生物体内RNA携带100多种化学修饰，其中约60％为RNA甲基化修饰，而在甲基化修饰中又以N5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5c)修饰最为普遍。m5c是胞嘧啶核苷酸上第五位N上发生甲基化，其主要分布于CG富集区域，编码RNA和非编码RNA中存在大量的m5c甲基化位点。m5c在转运RNA(transfer RNA，tRNA)和核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)中高丰度且稳定存在，已证实其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、信使RNA(messenger RNA，mRNA)出核和细胞发育及基因表达等方面。

m5c在哺乳动物的mRNA中十分保守，而在不同组织中参与修饰的基因却具有特异性。研究发现，NSUN2(writer)蛋白是主要的mRNA m5c甲基转移酶，其活性依赖于C271和C321位点，且NSUN2功能缺失导致mRNA的出核受到抑制。出核调控蛋白ALYREF(reader)通过第171位赖氨酸特异性结合m5c修饰位点，从而促进mRNA出核。

目前发现的与m5c相关的基因主要有三类，分别为1)writers:甲基化酶，介导RNA甲基化修饰过程，包括NSUN1，NSUN2，NSUN3，NSUN4，NSUN5，NSUN6，NSUN7，DNMT1，DNMT2，DNMT3A和DNMT3B；2)erasers:去甲基化酶，包括TET2；3)readers:m5c结合蛋白，识别并结合mRNA上的m5c位点，包括ALYREF。细胞m5c状态由一组“writer”、“eraser”和“reader”的基因介导：“writer”形成一个甲基转移酶复合物和m5c水平增强，而“eraser”是m5c脱甲基酶，与“writer”功能相反；“reader”是解码的效应器，将m5c甲基化信息转化为功能信号。

一般来说，m5c在mRNA上的分布特征在哺乳动物中十分保守，而在不同组织中修饰的基因具有特异性。m5c相关基因的失调与肿瘤发生发展和治疗抵抗相关：例如，NSun2在m5c上的转录后甲基化tRNA抑制总蛋白合成，m5c RNA甲基化作为调节总蛋白合成和细胞命运的重要途径；NSUN2介导的甲基化保护tRNA不被剪切成非编码的5'tRNA片段，从而促进蛋白质翻译和分化，外部应激刺激抑制NSUN2的活性，导致其切割成5'tRNA片段，然后降低人类细胞中的蛋白质合成。抑制肿瘤中的转录后甲基化促进干细胞功能和肿瘤发生。然而，细胞毒性应激后需要重新激活m5c RNA甲基化途径才能退出特定的翻译抑制程序。因此，激活RNA甲基化或抑制tRNA切割对肿瘤起始细胞响应细胞毒性应激的存活至关重要。

目前，虽然已经发现m5c与不同类型的肿瘤发发展均有关系，但其与免疫治疗疗效评估中的作用和机制仍然知之甚少。肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌的一种，属于非小细胞癌，较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺，发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部X线检查时被发现，表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但有时早期即发生血行转移。