[发明专利]用于鉴定柑橘大实蝇的LAMP引物组及其应用

说明书

本发明公开了用于鉴定柑橘大实蝇的LAMP引物组及其应用。所述LAMP引物组由引物‑F3、引物‑B3、引物‑FIP和引物‑BIP组成，核苷酸序列依次如序列1‑序列4所示。本发明的LAMP引物组可应用于鉴定待测实蝇是否为或候选为柑橘大实蝇，也可应用于检测待测样本是否含有或候选含有柑橘大实蝇。采用LAMP引物组鉴定柑橘大实蝇，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定柑橘大实蝇的LAMP引物组及其应用。

背景技术

柑橘大实蝇Bactrocera minax(Enderlein)，隶属于双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)寡毛实蝇属Bactrocera大实蝇亚属Tetradacus，是严重危害柑橘的害虫之一。随着国内柑橘种植面积增加与柑橘类水果贸易日益频繁，柑橘大实蝇发生范围和危害不断扩大。

柑橘大实蝇专性寄生柑橘类果树，其幼虫在被害果内取食囊瓣，个别也能取食种子，为害后期果实内呈絮状。幼虫可在囊瓣间辗转纵横蛀食。早期产卵孵化的幼虫数量较多，导致被害果未熟先黄，造成落果、腐烂。该虫不仅严重降低柑橘的产量和品质，而且也大大挫伤农民种植柑橘的积极性，同时消费者在购买到被蛀食果实后，使消费者的恐慌心理，造成严重经济损失。柑橘大实蝇主要通过幼虫在蛀果内随水果贸易传播，成虫也具有一定的飞行能力，具有一定传播能力。因此，如何有效快速、准确地鉴别柑橘大实蝇，对于柑橘类水果贸易领域的害虫监测和植物检疫领域的害虫鉴定等，显得尤为重要。

目前柑橘大实蝇的鉴定方法主要采用传统的形态学鉴定和分子鉴定技术。柑橘大实蝇与蜜柑大实蝇形态相似，幼虫的鉴定缺少明显的鉴定特征，柑橘大实蝇成虫与蜜柑大实蝇成虫的区分鉴定，雌虫可依靠产卵器特征区分，但雄虫的鉴定仅有胸部鬃毛作为鉴别特征，需要专业的形态学知识储备，形态学鉴定困难。现有的PCR分子鉴定技术虽然可实现快速、准确的鉴定，但需昂贵的仪器设备，鉴定成本高，不适于在基层部门中推广应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。LAMP是一种简便高效的核酸恒温扩增技术，可以在短时间内大量扩增反应产物，具更高灵敏度，且操作简便，无需特殊仪器，检测结果可由肉眼观察判断，适于基层部门推广应用。LAMP中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何有效快速、准确地鉴定柑橘大实蝇。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于鉴定或辅助鉴定柑橘大实蝇的引物组。

本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定柑橘大实蝇的引物组由引物-F3、引物-B3、引物-FIP和引物-BIP组成；

所述引物-F3为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物-B3为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物-FIP为如下a5)或a6)：