[发明专利]一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用。属于瞬时转化技术领域。包括：取处于初花期的文冠果花序放入100g/L的葡萄糖溶液中，移入光照培养箱培养；侵染液侵染文冠果花瓣；将侵染后的文冠果花序依次放入放入50g/L和100g/L的葡萄糖溶液中培养；重复步骤(2)～(3)两次，完成瞬时转化；置于光照培养箱中继续培养。本发明通过前后不同浓度高渗葡萄糖溶液处理，一方面加大转化效率，另一方面缩短花色观察时间；在侵染液中加入葡萄糖加快目的基因对花色的调控，缩短周期；瞬时表达质粒注射的方法，避免了原有的农杆菌介导的瞬时转化过程中因农杆菌、震荡、抽真空对花瓣造成的损伤，具有遗传转化周期短、效率高的优点。

技术领域

本发明涉及瞬时转化技术领域，更具体的说是涉及一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用。

背景技术

文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)属无患子科文冠果属，是木本油料植物。文冠果花色多样，花色转变明显，同一花序实现多花期，多花色(绿色、黄绿色、浅红色、紫红色等颜色)；通常两年生可开花结果，是林木上研究花色转变的理想生物材料。但由于文冠果转基因技术不是很成熟、周期较长，通过传统的遗传转化方法研究基因的花色调控机制较为困难。

瞬时转化是一种快速有效的研究目的基因功能的转化方法，目前在多种植物的叶、根、茎、愈伤组织中得到应用。

现有技术中的瞬时转化方法多为农杆菌介导的瞬时转化，在该转化过程中农杆菌、震荡、抽真空等均会对花瓣造成的损伤，影响瞬时转化效果。

综上，如何提供一种损伤小、效率高的文冠果花瓣瞬时转化方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用。本发明方法可以实现目的基因在文冠果花中的瞬时转化，是快速研究其花色转变功能、直接观测表型的有利手段。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种文冠果花瓣瞬时转化方法，包括如下步骤：

(1)取处于初花期的文冠果花序，放入80～120g/L的葡萄糖溶液中，移入光照培养箱中培养2～3天；

(2)使用侵染液侵染文冠果花瓣；

(3)将侵染后的文冠果花序依次放入40～60g/L和80～120g/L的葡萄糖溶液中培养；

(4)重复步骤(2)～(3)两次，完成瞬时转化；

文冠果一个花序不是同时开花，只能分次侵染(第1次，第2次，第3次)，但一个花瓣只侵染一次。

(5)将完成瞬时转化的文冠果花序置于光照培养箱中继续培养7～10天。

优选的，所述步骤(2)的具体操作为：用无菌针30度倾斜轻刺花瓣基部偏上1～2cm处的表面薄膜，用无菌注射器吸取所述侵染液，对准伤口部位缓慢注入花瓣中，并使所述侵染液浸润整个花瓣。

优选的，所述步骤(3)的具体操作为：将侵染后的文冠果花序放入40～60g/L的葡萄糖溶液中，室温暗处培养12～24h；之后转入80～120g/L的葡萄糖溶液中，置于光照培养箱中继续培养2～4天。

优选的，所述侵染液中包括如下质量浓度的成分：IL-60-BS 2～5μg/mL、pIR-目的基因8～12μg/mL、MgCl₂10 mM、MES 10mM、Ace 40～60μM和葡萄糖3～6％。

侵染液中葡萄糖的加入，加快目的基因的表达和对花色的调控，缩短周期，保证了瞬时表达载体的作用时间。

优选的，所述pIR-目的基因的制备方法如下：