[发明专利]HDAC2基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了HDAC2基因敲除的BHK‑21细胞系的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术对口蹄疫疫苗生产用细胞系BHK‑21中的HDAC2进行基因敲除；发明人将用于敲除HDAC2的CRISPR质粒转染BHK‑21细胞后，利用抗生素筛选结合梯度稀释，用克隆环法分离到了多个细胞克隆；提取基因组DNA后进行PCR扩增、测序，成功鉴定到了1个HDAC2基因发生纯合移码突变的细胞克隆；其中HDAC2‑KO‑B3在Cas9预定切割位置处有1个碱基的缺失。HDAC2敲除的BHK‑21细胞系中口蹄病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度有显著提高，且HDAC2敲除后对细胞生长速率无显著影响，说明其有用于口蹄疫疫苗生产的前景。为进一步在悬浮培养型BHK‑21细胞中敲除HDAC2，直接用于口蹄疫疫苗生产奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种HDAC2基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)感染所引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病，主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物。该病传播途径多、传播速度快，曾在世界范围内造成巨大经济损失，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病之首。目前对于该病的防控以疫苗免疫预防为主，而且传统灭活疫苗仍占据市场主导地位。口蹄疫灭活疫苗的生产完全依赖口蹄疫病毒在幼仓鼠肾传代细胞BHK-21(Baby hamster kidney cell)中的复制。BHK-21细胞最早由MacPherson和Stoker于1962年利用1日龄叙利亚仓鼠肾细胞建系。该细胞生长迅速、病毒敏感谱较广，随后被用于多种病毒的增殖及疫苗生产，如口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、新城疫疫苗等。原始的BHK-21细胞为贴壁生长型细胞，不利于商业化疫苗的大规模生产。Capstick等对BHK-21细胞进行了悬浮培养驯化，并于1965年在不锈钢发酵罐中用驯化的悬浮培养型BHK-21细胞培养生产了口蹄疫疫苗，开启了利用悬浮培养BHK-21细胞生产口蹄疫疫苗的新时代。我国口蹄疫疫苗的生产工艺最早是将贴壁培养的BHK-21细胞经多次传代扩大培养后接种口蹄疫病毒进行生产。2009年开始我国口蹄疫疫苗生产企业相继进行了BHK-21细胞悬浮培养的工艺改造，在短短几年时间内全部实现了生物反应器悬浮培养工艺。目前贴壁生长型BHK-21细胞主要用于实验室的前期研究，而商业化疫苗生产则完全采用悬浮培养型BHK-21细胞。尽管BHK-21细胞在口蹄疫疫苗生产中已经应用了50多年，除了悬浮培养驯化外，目前尚没有研究利用遗传手段改造BHK-21细胞，使其更有利于病毒复制，并将遗传改造后的BHK-21细胞应用于口蹄疫疫苗的生产。

CRISPR/Cas9技术是近些年迅速发展起来的能够用于哺乳动物细胞的新型基因编辑技术，在很多领域均具有非常好的应用前景。利用该技术对BHK-21细胞中调控口蹄疫病毒感染与免疫的相关基因进行改造，提高口蹄疫病毒在BHK-21细胞中的复制效率，将有助于提高口蹄疫疫苗的产量或质量。

蛋白乙酰化是一种重要的蛋白翻译后修饰，已有的研究表明蛋白乙酰化通过病毒本身蛋白的乙酰化、宿主免疫相关基因启动子区域组蛋白的乙酰化、免疫信号分子的乙酰化等多种方式影响病毒的感染与免疫过程。蛋白乙酰化水平受到组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的动态调节。哺乳动物中HDACs家族共有18个成员，且不同HDAC具有特定的功能，无明显的功能冗余性。HDACs家族的个别成员已经被证明在病毒-宿主相互作用过程中发挥着重要的调控作用。然而，关于蛋白乙酰化以及HDACs家族基因在口蹄疫病毒感染过程中的作用却并不清楚。

发明内容

本发明旨在提供一种有望用于口蹄疫疫苗生产的基因编辑BHK-21细胞系。即利用CRISPR/Cas9技术，在BHK-21细胞中敲除HDAC2后，口蹄疫病毒复制速率加快，病毒滴度显著提高，有望用于口蹄疫疫苗生产，提高疫苗产量及质量。