[发明专利]一种检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒，所述引物具有4个，与现有技术相比，本发明具有如下优点：提供了4条不同的特异性引物，故而对虾肝肠胞虫的检测结果准确度更高，结合LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及快速检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒。

背景技术

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)，隶属于真菌界、肠胞虫科(Enterocytozoonidae)、肠胞虫属(Enterocytozoon)，是一种专性细胞内寄生虫。该寄生虫可以感染斑节对虾(Penaeus monodon)和凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)等多种养殖虾类,导致其生长缓慢，甚至引起慢性死亡。尽管在早期的报道中，EHP的流行和感染强度均较低，但近几年EHP引起的对虾肝胰腺微孢子虫病(Hepatopancreatic microsporidiosis,HPM)在亚洲对虾养殖业中的流行逐步扩大，给对虾养殖业造成严重的经济损失。可由虾农在“池塘边”直接操作的高效检测技术的发展，对于该病原的防控具有重要意义。

分子检测方法，特别是核酸扩增，通常具有较高的灵敏度和特异性。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是许多对虾病原诊断的传统方法。多种基于PCR的方法(包括一步PCR、巢式PCR等)已被用于EHP检测。但一步PCR技术对检测设备和操作环境有较高要求、操作较为繁琐，反应仅需1对引物，易受干扰，特异性不足，检测限通常在10³-10⁴Copies/μL，这对于检测少量病原携带者的感染状态不足够灵敏；巢式PCR需两对引物，其特异性和检测限有所提高，但其所需检测时间也相应增加，给实际生产中快捷应用理念相悖；此外，目前已建立的用于EHP检测的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescentquantitative PCR)方法(包括TaqMan PCR和SYBR Green I PCR)，可实现病原检测定量，但其所需设备昂贵，操作复杂，数据读取繁琐，难以在虾农中进行推广；核酸恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增，且不受样本中常规抑制物干扰，具有简单、快速、特异性强的特点，可不依赖任何特殊的仪器设备实现现场快速检测。然而,LAMP技术具有优势的同时，由于其是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增，且开放结果观察易造成气溶胶污染，假阳性较高，影响检测结果。

微流控芯片(Microfluidics chip)检测技术是一种基于微流体界面精确操作的技术，可把样品检测过程集成到一个数平方厘米的芯片上。可通过在微米及亚微米级的微管道网络中进行微量流体的操控、处理和反应，达到分子检测的目的。该技术克服了传统检测技术的缺陷，具有制作成本低、能耗物耗少、设备小型化、分析速度快、灵敏度高，操作简单自动化、一体化、集成化等特点。基因扩增和产物的检测可一步完成，灵敏度及反应时间均优于基于PCR的多种检测方法，可实现对病原核酸的高通量快速检测，实现虾农对水产疫病的现场日常监测和早期诊断。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种能快速检测虾肝肠胞虫的引物。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状提供一种应用有上述引物的试剂盒。

本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：该检测虾肝肠胞虫的引物，其特征在于：所述引物为：

F3：GATGCAAAGAGATATGTTGAAAG；

B3：TGCTTTAAGGTTTACAGTGTT；