[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白LT29构建及其表达纯化方法和应用

权利要求书

1.结核分枝杆菌融合蛋白LT29的构建及表达纯化方法，其特征在于，

首先将结核分枝杆菌活动期抗原EAST6和结核分支杆菌潜伏期抗原Rv2626c进行基因水平的融合，构建重组载体pET30a(+)-LT29；构建好的pET30a-Rv2626c质粒，在Rv2626c基因前面插入ESAT6基因，在ESAT6下游引物中加入一段linker(GGGGS)₃，构成了重组质粒pET30a(+)-LT29(pET30a(+)-ESAT6-linker-Rv2626c)；

然后，将pET30a(+)-LT29质粒载体转化入大肠杆菌E.coli中进行融合蛋白LT29的表达；

最后，根据该蛋白的蛋白特性，通过盐析、疏水层析与离子层析相结合的方法纯化该融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白LT29的构建及表达纯化方法，其特征在于，

包括以下步骤：

1)构建重组基因载体pET30a(+)-LT29(ESAT6-linker-Rv2626c)

根据pET30a-Rv2626c、pET30a-ESAT6重组基因序列，设计引物扩增ESAT6基因片段；引物分别为：

上游引物：

CGCCATATGATGATGACAGAGCAGCAG，其中斜体为NdeⅠ限制性酶切位点；

下游引物：

CGAGCTCGAGACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGCGAACATCCCA，

CGAGCTCGAGACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGCGAACATCCCA，其中斜体为SacⅠ限制性酶切位点，下划线部分为linker；

以pET30a(+)-Rv2626c质粒为载体，用上述两条引物，PCR扩增出EAST6-linker基因产物；该PCR产物经纯化后，用NdeⅠ和SacⅠ进行双酶切，克隆构建在质粒pET30(+)a-Rv2626c上，构建成pET30a(+)-LT29(ESAT6-linker-Rv2626c)载体；

2)新型融合蛋白LT29的表达

将构建成功的pET30a(+)-LT29(ESAT6-linker-Rv2626c)载体转化入表达载体大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中；活化表达EAMMH蛋白的E.coli BL-21(DE3)菌体，取1ml活化后菌体加入200mlLB培养基中37℃震荡培养4h；加入蛋白诱导剂IPTG(1.0mmol/L)100ul，29℃诱导振荡培养12h；4℃10000G离心10min收集菌体；菌体重悬于PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O20mMol/L，Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，pH7.4)10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌0.5h(180～200W,超声3s停3s)；10000G离心15min后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

3)新型融合蛋白LT29的纯化

大量表达融合蛋白LT29，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎0.5h左右，4℃/10000G离心10min,离心后收集含LT29蛋白的上清；上清用0.45um滤器过滤；首先，将该融合蛋白用体积分数30％的饱和硫酸铵溶液进行盐析；然后，盐析出的蛋白用PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，pH7.4)进行重悬；随后，将所收取的融合蛋白进行疏水层析，选用疏水层析材料Butyl Sepharose High Performance(GEHealthcare)进行纯化，以高盐PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，Na2HPO4·12H2O20mMol/L，NaCl 1Mol/L，pH7.4)上样，以PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，pH7.4)洗涤杂蛋白，ddH₂O清洗获得含有目的蛋白的样品以便下一步纯化；最后，将收取的纯化样本进行离子层析，选用离子层析材料DEAE Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)进行纯化，以PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，Na2HPO4·12H2O20mMol/L，pH7.4)上样，以20％体积分数的高盐PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，NaCl 1Mol/L，pH7.4)与80％体积分数的PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，pH7.4)洗涤获得目的蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析得最终纯化物。