[发明专利]同时鉴别β-内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试剂盒及其引物组

说明书

本发明公开了同时鉴别β‑内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测引物组，包括四对引物对：引物对A、引物对B、引物对C和引物对D，它们分别针对β‑内酰胺类抗生素耐药基因TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY。在此基础上，发明人进一步建立了相应GeXP快速检测方法及其试剂盒。实验证明，使用本发明可同时检测β‑内酰胺类耐药基因TEM、CTX‑M、SHV和/bla‑CMY，具有简便快速、特异性强、灵敏度高等特点，与药敏试验、测序等实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％。因此，本发明为常见的β‑内酰胺类耐药基因的检测提供了简便、高通量的检测试剂盒和检测体系，更符合实际的需要。本发明研究从基因上了解广西地区细菌对β‑内酰胺类抗生素的耐药情况，为调查耐药基因流行趋势提供一种全新的技术手段，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及抗生素耐药检测技术领域，尤其涉及同时鉴别β-内酰胺类抗生素耐药基 因的GeXP多重PCR检测试剂盒及其引物组。

背景技术

抗生素的发明和应用是人类在20世纪医药领域最伟大的成就之一。由于广谱抗菌药 的滥用，细菌耐药性的产生，给人类又造成了新的灾难。随着动物养殖业向规模化、集约化方法发展，饲养密度提高，加上管理用药不合理，导致动物细菌性疾病的危害加重。动 物源食品也随之受到污染。近年来，由食源性致病菌引起的食物中毒在世界各地均有报道，引发公共卫生安全问题。细菌耐药性是微生物对抗生素的一种自然反应，每一种抗生素进入临床用药后随之而来的是细菌的耐药，这种耐药可能是天然的，也可能通过变异或者基因转移获得，不同的抗生素有其主导的耐药机制。细菌耐药带来的问题日愈严重，随着分子生物学技术的发展，细菌耐药性相关耐药基因陆续被鉴定。因此，要控制细菌耐药性， 不仅要合理使用抗生素，还应该建立细菌耐药性相关耐药基因监测网，准确系统连续地检 测本地细菌耐药情况，从而做好耐药趋势的追踪和控制。

细菌耐药性监测技术的发展对于控制细菌耐药性十分重要。常规的细菌耐药性检测方 法有K-B法(药敏纸片扩散法)，MIC法(最小抑菌浓度法)和E-test法等，这些方法对细菌耐药性的检测有很重要的作用。然而，这些传统方法耗时长，操作繁琐，灵敏度低， 而且只能检测耐药表型不能检测耐药基因的流行规律，不能从根本上指导临床用药。因此，急需建立一种高通量、快速、灵敏又能同时检测耐药表型和基因型的检测方法，以达到监测和控制细菌耐药趋势的目的。

目前监测耐药基因的方法很多，如PCR技术、核酸杂交技术、基因芯片技术、质粒指纹图谱、DNA序列测定技术等，其中单重PCR以及基于PCR技术衍生出的多重PCR的研究 报告最多，也具有一定的应用前景。PCR技术具有操作简便、快速、特异性强和敏感性高 等优点，但它检测的基因比较单一；多重PCR可同时检测几种目的基因，但需几对引物组 合在一起同时竞争性扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就相应降 低。此外，PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的 条带，难以达到高通量检测目的。多重荧光PCR由于探针要标记不同发光波长的荧光基团， 如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰。核酸杂交技术、基因芯片技术、质粒指纹图谱、 DNA序列测定等其他技术具有特异性好的特点，可操作过程繁琐，价格昂贵，远不能满足 临床需要，还需要大量的研究来克服目前分子生物学方法应用于临床的不足。因此，目前 急需建立一种同时可检测多种细菌耐药基因的高通量快速检测方法。

GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国Beckman Coulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台。GeXP多重PCR扩增采用荧光 标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引 发多重体系扩增。该技术可同时对30种目的基因进行检测分析，从而实现真正意义上的高通量检测鉴别多种耐药基因的目的。