[发明专利]一种薄壳山核桃果实活体接种的方法

说明书

本发明公开了一种薄壳山核桃果实活体接种的方法，属于生物工程技术领域。该方法包括以下步骤：1)挑选薄壳山核桃树上的健康果实，消毒，刺伤果实待用；2)将致病菌株进行活化至菌丝布满整个培养基，打取菌饼，有菌丝的一面贴紧果实的刺伤伤口处；使用菌饼覆盖装置盖住菌饼用力按压使其黏牢在果实上面；3)调查接种点的发病情况。其中，菌饼覆盖装置包括覆盖管管体、覆盖管管盖和无菌脱脂棉，覆盖管管体的底部封闭，并设有压实的处于水饱和状态的无菌脱脂棉，通过覆盖管管盖控制覆盖管管体的开闭状态。使用本发明的菌饼覆盖装置能够对菌饼进行保湿，且能够防止外界其他病原菌的浸染干扰结果，发病组织再分离致病菌株的分离率高。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种薄壳山核桃果实活体接种的方法。

背景技术

薄壳山核桃(Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch)，又名美国山核桃、长山核桃，胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(Carya)落叶乔木。其为优良的绿化树种，木材上等的军工用材，果实是理想的保健品。树形高大挺拔，根系发达，耐水湿，干果、油料、绿化和用材于一身，具有较好的经济效益、生态效益和社会效益。它被引种到我国已有100多年的历史，是一个集经济、社会和生态效益于一身的优良经济树种。

近几年，随着人们生活品质的日益提升，对坚果类食品的需求逐渐增多，薄壳山核桃种植面积不断地扩大，同时，随着集约化经营强度的增加，薄壳山核桃的病害也相对增多，严重的影响了生产者的利益，也制约着我国薄壳山核桃的质量和品质。其中薄壳山核桃黑斑病危害最为严重。该黑斑病为多种病原菌复合侵染引起的，通过组织分离法，将新鲜的病害组织用75％的酒精进行表面消毒，再用无菌水进行冲洗，用无菌的解剖刀将组织切成5mm的小块，接种于PDA培养基上培养。通常，为了防止细菌污染，可以在培养基中加入卡那和氨苄等抗生素。培养3-5d后，取最边缘的菌丝，挑一小块移至新的培养基中进行纯化。分离到的菌种主要有炭疽菌，拟盘多毛孢，拟茎点霉等，为了证明其是否为病原菌，需要进行一个菌种致病性的测定，将其接种到活体寄主上，观测寄主是否发病。

常规的薄壳山核桃果实活体接种方法为将菌饼接放到果实上，用封口膜将菌饼封住缠绕在果实上，但其存在操作难度较高，操作时间长，封口膜受干易断裂等问题。

发明内容

鉴于现有技术存在的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题在于提供一种薄壳山核桃果实活体接种的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种薄壳山核桃果实活体接种的方法，包括以下步骤：

1)挑选薄壳山核桃树上的健康果实，消毒，再用灭过菌的针管刺伤果实待用；

2)将致病菌株接种到PDA培养基上进行活化，至菌丝布满整个培养基；用灭过菌的打孔器将PDA培养基中的菌丝切割成菌饼，有菌丝的一面贴紧果实的刺伤伤口处；使用菌饼覆盖装置盖住菌饼用力按压使其黏牢在果实上面；

3)调查接种点的发病情况；

菌饼覆盖装置包括覆盖管管体、覆盖管管盖和无菌脱脂棉，覆盖管管体的底部封闭，并设有压实的无菌脱脂棉，无菌脱脂棉处于水饱和状态，通过覆盖管管盖控制覆盖管管体的开闭状态。

进一步的，步骤1)中，挑选9～10月份的薄壳山核桃树上的健康果实，用75％酒精消毒2min，无菌蒸馏水冲洗3次，再用灭过菌的针管刺伤果实待用。

进一步的，步骤2)中，将致病菌株接种到PDA培养基上进行活化，在25℃～28℃培养3-5d至菌丝布满整个培养基。

进一步的，步骤2)中，致病菌株包括拟盘多毛孢、炭疽菌和拟茎点霉。

进一步的，步骤2)中，用灭过菌的打孔器将PDA培养基中的菌丝切割成5mm×5mm的菌饼。