[发明专利]一种花鲈血管囊细胞的分离和原代培养方法

说明书

本发明公开了一种花鲈血管囊细胞的分离和原代培养方法，取完整的血管囊组织经缓冲液和培养基润洗后，将其切成不少于3块，然后将血管囊组织块置于孔板中，以优化的培养条件静置培养。本发明采用的花鲈血管囊分离方法，可以减少在操作及润洗过程中的细胞流失以及细胞形态损伤；本发明采用的原代培养方法可让血管囊细胞大量贴壁，传代效果好。

技术领域

本发明涉及鱼类细胞培养方法，具体涉及一种花鲈血管囊细胞的分离和原代培养方法。

技术背景

花鲈(Lateolabrax maculatus)硬骨鱼纲(Osteichthyes)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)、鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Percoidei)、鮨科(Serranidae)、花鲈属(Lateolabrax)。花鲈广泛分布于中国、朝鲜和日本沿海，具有适温范围广、适盐性强、肉质鲜美、经济效益高等特点，是我国重要的水产养殖品种。

花鲈属短日照季节性繁殖鱼类，北方产卵期为10月-12月，南方为11月-翌年1月。季节性繁殖鱼类会出现光周期反应且甲状腺素会参与季节性生殖调控，由于花鲈繁育正值寒冬腊月，低温导致的一系列问题(如仔鱼成活率低，饵料培育成本较高等)成为花鲈苗种生产规模化的主要制约因素，通过调节光周期长短可以诱导花鲈性腺提前或推后成熟，因此通过调控生态环境条件，实现不同季节的产卵繁殖，已经是花鲈人工繁殖需要解决的重要问题。研究发现血管囊是调节鱼类光周期的器官，原代细胞与体内细胞特性相近，能较真实的反应体内细胞活性与功能。鱼类细胞能为鱼类病毒分离、抗病毒机制、疫苗研发、转基因技术、嵌合体组织工程等研究提供极大便捷，且设施人力等资源要求相对活体实验低，重复性好，研究周期短。目前，国内外还没有花鲈血管囊分离和原代培养相关的资料，因此，很有必要建立规范的、可复制的花鲈血管囊细胞分离与原代培养的方法，为花鲈季节性繁殖研究提供实验平台。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种花鲈血管囊细胞分离与原代培养的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种花鲈血管囊细胞的分离和原代培养方法，取完整的血管囊组织经缓冲液和培养基润洗后，将其切成不少于3块，然后将血管囊组织块置于孔板中静置培养。

本发明中，将完整的血管囊组织切成3-4块即可，若血管囊组织块少于3块，从切面爬出细胞量太少，直接导致细胞贴壁情况差，若血管囊组织块多于5块，血管囊本身只有3-4毫米，由于过度切割，组织散烂，在滴加培养基的过程中，细胞大量悬散在培养基里，而血管囊的悬液细胞几乎不贴壁，悬浮的细胞活性低无法生长。

本发明中，润洗和培养中使用的培养基为L-15完全培养基，其中包含300-500U/mL青霉素、300-500U/mL链霉素和10-30％FBS。优选地，L-15完全培养基包含350-450U/mL青霉素、350-450U/mL链霉素和15-25％FBS。

本发明中，所述培养为将血管囊组织块铺展在血清浸润过的孔板上，血清浸润可帮助细胞贴壁，然后置于28℃培养箱中倒置培养1.5-2小时，之后在组织块正上方滴加少量L-15完全培养基，此方法可帮助组织块铺展避免血管囊组织块飘起，有利于细胞析出贴壁，过夜培养12小时后，将培养基补足至500微升，正常大气压下培养，利用显微镜观察其生长铺展状况。一般培养4天后可明显观察到大量贴壁细胞，一周后可传代培养。

本发明中，润洗中使用的缓冲液为双抗杜氏磷酸盐缓冲液(双抗DPBS)，含有400U/mL青霉素和400U/mL链霉素。润洗中使用的培养还包括双抗L-15培养基，含有400U/mL青霉素和400U/mL链霉素。

本发明的优点在于：

1.本发明采用的花鲈血管囊分离方法，可以减少在操作及润洗过程中的细胞流失以及细胞形态损伤。

2.本发明采用的花鲈血管囊培养方法可让血管囊细胞大量贴壁，传代效果好。