[发明专利]一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法

权利要求书

1.一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法，其特征在于，所述高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法包括以下步骤：

S1：对金钗石斛原球茎制备，选用金钗石斛蒴果，并建立种子诱导原球茎与增值培养体系，并在此基础上绘制原球茎生长曲线，利用GC/MS方法鉴定其中石斛碱的含量；

S2：较高繁殖系数金钗石斛原球茎制备，培养基成分与激素类型、用量是影响植物组织培养最主要的因素之一，对生长状态进行描述和绘制生长曲线；

S3：金钗石斛原球茎中石斛碱含量测定，以标品石斛碱作为对照，并进行标准曲线制作；

S4：分离金钗石斛内生菌并鉴定其次生代谢产物，将纯化后的菌种划线取样、涂片，在显微镜下观察形态，记录；

S5：金钗石斛中内生菌次生代谢产物鉴定，同时将菌种转至真菌液体培养基中,28℃培养7-15d,将菌样、培养液分别提取产物，进行GC/MS分析，并与金钗石斛茎段次生代谢产物、石斛碱标品进行比较分析，挑选次生代谢产物中含有石斛碱的菌种作为共培养的候选菌株；

S6：建立金钗石斛原球茎与内生菌的共培养体系选用在生长曲线中处于上升期的原球茎，转入植物生物反应器中，接种金钗石斛的内生菌，添加液体培养基，温度25℃，采用间歇式浸没法进行共培养，在共培养前后检测金钗石斛原球茎的干湿重变化，检测其中的石斛碱含量；

S7：优良菌株筛选，将S6得到的候选菌株转入添加有金钗石斛原球茎的培养瓶中，分别记录接种后7-15d原球茎干湿重变化、其中石斛碱含量变化，以石斛碱得率最高的菌株作为共培养体系的受试菌；

S8：共培养体系优化，以原球茎的生长时期、相对接种量、液体培养基组成、培养温度等作为参数，结合GC/MS检测得到石斛碱的得率进行正交实验设计、响应面法优化共培养体系；

S9：内生菌与金钗石斛原球茎高产石斛碱网络绘制，进行转录组学检测；

S10：转录组学分析，将组装得到的所有Unigenes，与NCBI的Nr(非兀余蛋白数据库)、Nt(非冗余核酸数据库)数据库、Swissprot蛋白数据库、COG数据库以及KEGG蛋白数据库分别进行比对，对unigenes进行功能注释及GO富集分析，同时对三代转录组得到的数据对其中的转录剪切、单基因变异等信息进行进一步补充，完善转录组数据信息；

S11：绘制石斛碱积累的功能基因代谢网络，以KEGG等数据库为依托，结合RNA-Seq揭示的基因表达差异信息，进行代谢通路分析，采用DAVIDDAVID生物功能簇类分析，对功能分析及信号传递通路分析结果进行整合，绘制金钗石斛与内生菌作用高产石斛碱信号传递网络，结合标识蛋白和标识代谢物相关信息，对次生代谢途径终产物进行推导和验证；

S12：关键基因筛选与初步验证，对转录组KEGG功能注解的次生代谢网络中与石斛碱相关的基因作为待选，这些基因中与代谢组检测中的时间节点中与石斛碱含量变化具有高度相关性作为目标基因，进行Q-PCR验证。

2.根据权利要求1所述的一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法，其特征在于：所述步骤S1中诱导和继代材料为1/2MS+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+30g/L马铃薯，pH5.8；1/2MS+0.3mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA10％土豆+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 5.8。

3.根据权利要求1所述的一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法，其特征在于：所述步骤S2中采用正交实验与响应面法对金钗石斛原球茎培养中的有机种类与浓度、碳源种类与浓度、激素种类与浓度进行优化。

4.根据权利要求1所述的一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法，其特征在于：所述步骤S3中取金钗石斛原球茎干燥粉末0.5g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，加pH＝4的HCl溶液20mL，震荡30min，然后加入氨水调pH＝10，加氯仿50mL，称重，回流提取2h，称重，以氯仿补足失重，精密量取续滤液10.0mL，减压回收溶剂至干，加甲醇溶解，定量转入2mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，密塞，备用。