[发明专利]一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用，本发明运用共价结合法固定多巴脱羧酶技术，通过采用高比表面积的氧化石墨烯作为载体，对氧化石墨烯表面进行修饰，在载体表面引入能够与酶发生特异性共价反应的功能基团，并在温和条件下与酶进行键合固定；通过协同催化效应，提高酶的稳定性和重复利用率。此制备技术可以应用于酶脱羧领域，环保无污染，后处理简单，转化率高，可重复利用，尤其适于脱羧酶的固定。

技术领域

本发明属于生物催化有机合成领域，具体涉及一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用。

背景技术

脱羧酶是一种反应速度极其剧烈，且容易受到产物抑制的一类酶。多巴脱羧酶能够催化多巴（DP）脱羧产生多巴胺(DA)。医学上，多巴胺可用于治疗休克，心力衰竭，支气管哮喘等疾病。此外，多巴胺在碱性条件下还可以自聚为聚多巴胺，拥有着良好的稳定性和水相容性，可用于对纳米材料的改性。但是多巴胺能严重抑制酶的活性，使其无法做到高效生产。

石墨烯具有巨大的比表面积、独特的二维结构及化学稳定性，有优异的电学、力学、热学及机械性质，已成为当前开发新型催化剂载体的新领域。石墨烯衍生物—氧化石墨烯(GO)，包含多个基团，如羟基、羧基、环氧基团及羰基，易被化学修饰改性，并能在溶剂中很好地分散。脱羧酶表面有许多游离的羟基、酚羟基、羧基、氨基、巯基等功能基团，可与羧基、醛、酮等发生醚化、烷基化、酰化等反应，被共价修饰到石墨烯表面。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用，该方法选用高比表面积氧化石墨烯作为载体，运用共价结合法固定多巴脱羧酶技术，对氧化石墨烯表面进行修饰，在载体表面引入能够与酶发生特异性共价反应的功能基团，并在温和条件下与酶进行键合固定；所得固定化酶通过协同催化效应，提高反应转化率，稳定性高。另外，此制备技术环保无污染，后处理简单，转化率高，可重复利用，对拓展酶催化脱羧的工业化技术应用开发有重要意义。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案：

一种制备石墨烯固定化酶的方法，包括以下步骤：

步骤1，取1mg/mL氧化石墨烯GO水分散液，加入NaOH和氯乙酸钠固体，使NaOH和氯乙酸钠浓度保持在3-4mg/mL，水浴超声反应1-2h；用稀HCl中和，再用去离子水洗涤至中性，冷冻干燥，得到表面羧基活化的氧化石墨烯粉体，密闭保存，备用；

步骤2，将上述所得酸活化氧化石墨烯粉体加至含交联剂的水溶液中，超声20-30min后，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液中,使得EDC的终浓度维持在1.2-3mg/mL；常温下剧烈搅拌12-16h，使反应充分螯合后，离心分离，所得固体用去离子水反复洗涤，直至洗涤液pH呈中性；再在真空环境下干燥15-24h，得到表面活性基团修饰的功能化氧化石墨烯；

步骤3，取5mg表面活性基团修饰的功能化氧化石墨烯粉末加到5mL的 PBS 缓冲液(50mmol/L，pH7.0)中，超声5-10min后，加入含多巴脱羧酶（DDC）的 PBS 缓冲液(50mmol/L，pH7.0)中，使得混合液中多巴脱羧酶与功能化氧化石墨烯的初始浓度维持在0.2-0.6:1,在4℃下反应3-5h后，离心分离，洗涤，得到石墨烯固定酶催化剂颗粒，冷冻干燥后储存于-20℃下，即得石墨烯固定化酶。

作为改进的是，步骤2中所述交联剂为聚乙醇二胺（PEG-NH₂），6-臂聚乙醇二胺（6-br-PEG-NH₂）,甲氧基聚乙醇胺（mPEG-NH₂）或N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）中一种。

上述所得石墨烯固定化酶在催化多巴（DP）脱羧产生多巴胺上的应用。