[发明专利]一种重组耐盐腺苷酸环化酶及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种重组耐盐腺苷酸环化酶及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为1008 bp，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共335个氨基酸，理论分子量为36.09 kDa。该耐盐腺苷酸环化酶最适pH为10.0，最适温度为45℃，该重组耐盐腺苷酸环化酶活性随着氯化钠浓度的提高而增强，在氯化钠浓度为2.5 M时酶活性达到最大(约22倍)，具有良好的耐盐性，与现有报道的腺苷酸环化酶相比，其在高渗条件下能更好地提高生产效率，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种重组耐盐腺苷酸环化酶及其应用。

背景技术

环磷腺苷(cAMP)是生物体内广泛存在的一种生理活性物质，对糖代谢、脂肪代谢以及核酸和蛋白质合成等具有重要的调节作用。在生物体内，各类激素通过调节细胞内cAMP的生成与分解而发挥作用。激素将改变细胞活动的信息传递给靶细胞，再由cAMP传递到靶细胞内相应酶系而发挥作用。因此，通常将激素称之为“第一信使”，将cAMP称之为“第二信使”。cAMP作为激素的第二信使，参与生物体内多种代谢反应过程，对维持生物体正常生命活动起到重要作用，除此以外，cAMP还可以应用在植物生长调节、临床治疗和畜牧业生产等方面。

国内外工业化生产几乎全部采用化学合成法制备cAMP，除此之外，cAMP的制备方法还有发酵法以及酶法，酶法反应条件温和、周期短、副产物少、收率高、环境友好，所以具有一定的优势。利用腺苷酸环化酶生产cAMP，是一条可行的途径。腺苷酸环化酶的来源，可以是破碎的菌体细胞，或是从细胞中提取纯化的酶或固定化酶。现有的腺苷酸环化酶耐盐稳定性较差，其在较高的盐浓度以及逆境下活性降低的性质限制了它在食品、医药行业以及工业生产中的应用。通常高稳定性被认为是一个经济优势可以降低酶的消耗和补偿速率，此外，更稳定的酶可能对反应速率有着积极的影响，对于提高产品品质、获得更好地工业应用潜力、实现该酶的诸多应用具有重要的意义。目前，关于高渗条件下腺苷酸环化酶的应用研究鲜有报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种重组耐盐腺苷酸环化酶。

本发明另一个目的在于提出了该酶编码基因。

本发明进一步的目的在于提出包含上述编码基因的重组载体和重组菌。

本发明还有一个目的在于提供上述重组酶的制备方法及其应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种重组耐盐腺苷酸环化酶，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示，共335个氨基酸，理论分子量为36.09kDa。

本发明进一步提出了上述重组耐盐腺苷酸环化酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因长度为1008bp，所述编码基因来自于Thermobifida，halotolerans其序列由NCBI数据库获得。

进一步地，本发明提出了一种包含上述耐盐腺苷酸环化酶编码基因的重组载体。优选地，所述重组载体为融合型表达载体，优选出发载体为pET28a，所述耐盐腺苷酸环化酶编码基因插入pET28a的EcoR I和Nde I酶切位点之间。

同时本发明提供了包含所述的耐盐腺苷酸环化酶编码基因的重组菌株，优选地，所述宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明同时提出了上述重组耐盐腺苷酸环化酶的获得方法，包括以下步骤：

(1)构建重组菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-Thcya)并活化，将活化的重组菌接种到LB培养基中，培养至OD600_nm为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌泥；

(2)将步骤(1)得到的菌泥进行超声破碎，离心，上清液即为含耐盐腺苷酸环化酶的粗酶液。

其中，重组菌的构建方法如下：