[发明专利]一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白及其制备方法和应用。本发明通过将两个相同的抗原肽X通过连接肽尾首连接获得的二价重组抗原蛋白；其中，所述抗原肽X为包含抗原表位的短肽，所述短肽由6‑15个氨基酸组成；所述连接肽为(AP)nA，连接方式为X‑(AP)nA‑X，其中，n＝3、4、5、6或7。试验证明，本申请提供的多肽二价抗原蛋白免疫原性显著增强，无需偶联载体蛋白即可刺激动物体产生针对多肽的特异性抗体，这说明二价抗原在B细胞的激活过程中是必要的，为快速制备6×His‑Tag的单克隆抗体及类似多肽的单克隆抗体及短肽相关序列的免疫评价奠定基础。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

组氨酸标签(His-tag)，由六个His残基组成(HHHHHH)，其分子量小，基本对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白。因此，His-tag是最常用的一种蛋白表达标签，插入在目的蛋白的C末端或N末端均可，另外该标签也可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签使用，便于目的蛋白的纯化和检测。

因为His-Tag的免疫原性相对较低，以实验小鼠为宿主制备的His标签单抗的通常制备方法是：人工合成6*His多肽，必要时在末端添加偶联载体用到的特殊氨基酸。合成好此多肽后，通过化学方法将此多肽与载体蛋白偶联(如KLH、BSA、OVA等)，偶联完成后，再用偶联好的全抗原免疫实验小鼠，免疫结束后杀死免疫好的小鼠，无菌条件下取脾脏，与骨髓瘤细胞进行融合，用ELISA或者其它手段进行筛选出阳性的克隆，筛选到的细胞经过克隆化后即形成稳定的细胞株，将此细胞株进行体外培养或小鼠体内诱生腹水形成，再从培养基或者腹水中纯化即可得到His标签鼠单抗。该方法操作复杂，而且由于引入外源载体蛋白，为筛选到特异性针对His-Tag的单克隆抗体带来较大困难。

目前，表位肽的研究已经在疫苗相关技术领域得到广泛应用，但其仍存在免疫原性低的缺陷；此外，其他短肽，如从7肽库、12肽库随机筛选到的7肽或12肽等，也因为免疫原性相对较低而很难刺激机体产生免疫应答，通常研究者也是通过化学方法将此类多肽与载体蛋白偶联(如KLH、BSA、OVA等)，偶联完成后，再用偶联好的全抗原免疫实验小鼠，这一过程相对繁琐，为短肽类物质的免疫评价及单克隆抗体制备带来一定困难。因此，如何更高效便捷的获得具备高免疫原性的抗原蛋白是急需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白。

本发明的第二个目的在于提供上述高免疫原性的多肽二价抗原蛋白的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述述高免疫原性的多肽二价抗原蛋白的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白，将两个相同的抗原肽X通过连接肽尾首连接获得的二价重组抗原蛋白；所述抗原肽X为包含抗原表位的短肽，所述短肽由6-15个氨基酸组成；所述连接肽为(AP)nA，连接方式为X-(AP)nA-X，其中，n＝3、4、5、6或7。

优选的，所述抗原肽X的氨基酸序列为HHHHHH。

优选的，所述抗原肽X包含PCV3 Cap蛋白抗原表位¹⁴⁰KHSRYFT¹⁴⁶，其氨基酸序列为KHSRYFT；所述连接肽为(AP)₅A，连接方式为KHSRYFT-(AP)₅A-KHSRYFT。