[发明专利]一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种甲氧苄啶半抗原TMPH，进一步利用该甲氧苄啶半抗原TMPH与载体蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫小鼠，制备得到甲氧苄啶单克隆抗体。本发明制备得到的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，其对甲氧苄啶的最低检测限为0.025ng/mL、IC₅₀为0.80ng/mL、线性范围为0.12～5.19ng/mL，具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点，在甲氧苄啶的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术

甲氧苄啶(Trimethoprim，TMP)属于二氨嘧啶类化合物，自1969年抗菌增效剂-甲氧苄啶(TMP)发现以后，将甲氧苄啶与磺胺类药物组成复方制剂，可使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，使抗菌谱扩大、抗菌活性增强，从抑菌作用变为杀菌作用，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌有效，在兽医临床上应用十分广泛。但磺胺增效剂可导致瘙痒、皮疹，临床也有发现服用头孢羟氨苄/TMP致过敏性休克的报道，也有发生恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应。磺胺增效剂对小白鼠的半数致死量(LD₅₀)为2500mg/kg。大剂量使用时，会影响叶酸代谢和作用，可致白细胞减少和血小板减少，故长期使用时必须注意。

为了保护人类健康，控制磺胺类药物和甲氧苄啶的使用，中国、欧盟等国家和组织对它们的最高残留限量做出了规定，我国农业农村部2019年颁布的GB31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》，对磺胺类药物的规定是所有食品动物中脂肪的最大残留限量100μg/kg，对甲氧苄啶的规定是禽的肌肉、皮脂、肝脏、肾脏中的最大残留限量50μg/kg，并且规定日允许量为0～4.2μg/kg。同时，我国农业行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》(NY5070—2002)中规定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4种药物按总量计最大残留限量为100μg/kg，甲氧苄啶最大残留限量为50μg/kg。根据调查资料显示，贵州省和重庆市市场监督管理局公布，2020年7～10月，某些企业的鸡肉制品、猪肝样品中出现甲氧苄啶超标的情况。目前磺胺类及其增效剂残留的测定方法有高效液相色谱法配合紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，但是仪器分析法由于其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操作，不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于市场监测和现场监控。

基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，具有样本前处理简便、操作简单、快速、灵敏和高通量等特点，被誉为是21世纪最具有竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景，同时，近年来单链抗体与纳米抗体因具有稳定性高和可大量表达的优点，亦受到学者们的青睐。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。公开号为CN104341357A和CN108059620A的专利公开了一种甲氧苄啶半抗原、抗体，但这些抗原或抗体的检测限都比较高，检测灵敏度较低，难以用于快速准确地检测出食品中的甲氧苄啶残留。因此，提供一种抗原结构稳定、特异性高的抗体以及能够用于快速、灵敏、准确的检测甲氧苄啶的方法具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有甲氧苄啶检测方法的缺陷和不足，提供一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明提供的甲氧苄啶半抗原TMPH的合成方法简单，直接利用2-肼基甲氧苄啶的嘧啶环上的肼基进行修饰改造，在分子结构式上的肼基通过与乙醛酸的缩合反应生成，使其末端具有活性基团-羧基。

本发明的第一个目的是提供一种甲氧苄啶半抗原TMPH。

本发明的第二个目的是提供所述甲氧苄啶半抗原TMPH的制备方法。