[发明专利]一种蛇源成分快速检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供一种蛇源成分快速检测试剂盒及其应用，涉及生物物种鉴定技术领域。本发明首先筛选出一个蛇源通用内标准基因JUN(Gen bank No.EF144048.1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其位于染色体上，在蛇物种中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，可作为鉴定蛇源的靶基因。以该基因为靶序列设计了恒温扩增引物，恒温扩增反应产物用于胶体金核酸试纸条检测。恒温扩增反应结合胶体金核酸试纸条检测构成快速检测试剂盒，可快速、灵敏地检测蛇源成分，检测灵敏度可达0.8%（w/w）。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于现场实时检测。

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定技术领域，具体的说涉及一种检测蛇源成分的环介导等温扩增技术（LAMP）结合胶体金核酸试纸条检测试剂盒。

背景技术

我国以蛇做药有着悠久的历史，早在明朝医药学家李时珍所著的《本草纲目》就记述了关于蛇类的药用知识，到目前为止，可供药用的蛇类品种多达70余种。随着经济社会的发展，其药用和商用价值日益突出，蛇类资源的社会需求和应用逐年递增。一些不法商贩为了获取暴利，将伪品及混淆品掺杂在蛇类药材、制剂、皮革等制品之中，仅依据蛇类的外部形状很难进行正确判断。因此，为保证蛇类资源的安全使用，严厉打击蛇类药品掺假行为，加强蛇类物种的保护和管理，亟需开发快速、准确、低成本的蛇源成分快速检测方法。

近年来，蛇源鉴别的方法不断发展，除了传统的性状、显微、理化鉴定方法，许多新的鉴定技术和仪器设备被引入，如色谱鉴定、高光谱鉴定等，随着分子生物学的迅猛发展，涌现了一批分子鉴定技术，如各种分子遗传标记技术、测序技术等。

在脂肪酸、蛋白质检测鉴定领域，许靖等采用毛细管电泳指纹图谱技术，对蛇类药材进行指纹图谱研究，结果发现建立的指纹图谱有9个共有峰，并将其作为鉴别的特征性指纹峰。熊学敏等采用薄层色谱法对蛇粉胶囊中的乌梢蛇成分进行筛查，为定性鉴别提供依据，但该方法的局限性在于需要同对照样品反复比较，当无对照品时，难以鉴别。在核酸检测领域，王义权等根据线粒体基因Cytb基因的序列发现，该基因片段能区分鉴定金钱白花蛇与其他蛇种，结果表明，在对金钱白花蛇的PCR鉴别中，该引物的检出率为100%。Dubey等利用DNA mini-barcoding 技术对印度濒危蛇类物种进行分类研究和鉴定，在所研究的11种蛇类中都扩增出175 bp，在10种物种中扩增出245 bp，结果证实该技术的有效性。赵雪静等通过对金钱白花蛇及其他蛇类的Cytb基因序列进行比对分析，设计了一对能准确鉴别金钱白花蛇及其他伪品的引物，采用两步法PCR进行鉴别。陈康等通过对PCR反应退火温度与时间、变性温度与时间、循环数等因素的优化，并在产物中加入SYBR Green I染料，进行可视化检测，该检测方法可在30—40 min内完成。孙清萍等基于环介导等温扩增方法，以乌梢蛇12SrRNA基因序列为基础设计了一套LAMP 引物，实验结果表明，该方法在62 ℃孵育45min，即可完成扩增，实现了乌梢蛇的快速检测。

本申请以核酸为对象对蛇源内标准基因进行分子检测关键技术的研究，首先筛选蛇类物种染色体上低拷贝数基因作为内标准基因序列，然后将筛选出的特异序列通过环介导等温扩增—胶体金核酸试纸条联用，实现蛇源成分快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测蛇源成分的蛇源通用内标准基因。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测蛇源成分的LAMP结合胶体金核酸试纸条检测的快速检测试剂盒。

一种用于检测蛇源成分的基因，其为内标准基因JUN(Gen bank No. EF144048.1)，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明提供了上述内标准基因JUN在检测蛇源成分中的应用。