[发明专利]Survivin多点突变体重组蛋白及其应用

说明书

本发明提供Survivin多点突变体重组蛋白及其应用，所述通过基因工程制备，N端融合转导肽，将野生型Survivin第34位苏氨酸、第48位苏氨酸和第84位半胱氨酸中的两个或三个氨基酸突变为丙氨酸。多点突变的抗肿瘤和增敏效果都优于野生型和34位单突变的效果，并且将多点突变体重组蛋白与化疗药物联合使用作用于CSCs，发现多点突变体重组蛋白能有效促进化疗药物的杀伤作用，并有效降低化疗药物的使用量，是一种有效的肿瘤化疗的增敏剂，为解决癌症治疗过程中的耐药性问题提供了新的解决思路和方法。

技术领域

本发明涉及生物药物学领域，更具体地讲，涉及一种高效抗肿瘤Survivin突变体重组蛋白及其应用。

背景技术

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，具有抑制细胞凋亡、调控细胞有丝分裂和促进肿瘤血管生成的作用。Survivin在正常成人组织中几乎检测不到，而在肿瘤细胞中表达量很高。越来越多的研究发现，survivin在被认为是肿瘤发生的启动细胞的CSCs中的表达量更高，并赋予CSCs更强的抗凋亡以及耐药能力，使得癌症难以治愈。鉴于Survivin在癌细胞和CSCs中的高表达和多重作用，使得靶向Survivin的癌症治疗方法要比靶向单一致癌途径中的分子更具有优势。目前已经开发出许多抑制Survivin功能的策略，包括小分子抑制剂，反义寡核苷酸(ASO)，小干扰RNA(siRNA)和Survivin显性负突变。然而，小分子抑制剂，ASO和siRNA可能不适合靶向Survivin，因为它们不能消除已经存在的Survivin蛋白。考虑到易于制备，可直接与细胞内野生型survivin蛋白结合并可在蛋白表达的终末端抑制Survivin生物学功能的优势，Survivin负显性突变体引起了广泛关注。

Survivin负显性突变体是通过突变野生型survivin的功能必需氨基酸为非必须氨基酸所形成的一种非功能性蛋白质。由于其与野生型survivin具有相似的靶点，因此可竞争性抑制野生型survivin的功能。Survivin BIR结构域存在多种蛋白翻译后修饰位点，包括磷酸化位点、泛素化位点以及乙酰化位点，其中磷酸化修饰位点主要集中在BIR结构域，如Thr34和Thr48，磷酸化位点的突变能够破坏Survivin与Caspase的结合，进而释放Caspase的促凋亡功能。泛素化修饰位点同样在BIR结构域(1-88AA)上分布较多，如第23/62/78/79位赖氨酸(Lys)位点，该修饰主要用来调节Survivin与着丝粒的相互作用，促进有丝分裂的完成。乙酰化修饰位点则主要分布在Survivin的α-螺旋区，如第120/121/122/129/130Lys位点，该修饰主要是维持Survivin单体和二聚体形式之间平衡，进而介导Survivin的核输入与核输出。此外，Survivin上的Zn²⁺结合位点对于维持其二聚体的稳定性极为重要，而Survivin的抗凋亡功能的发挥主要依靠二聚体形式。综上，我们认为突变Survivin BIR结构域的磷酸化修饰位点和Zn²⁺结合位点能够更有效地破坏Survivin的抗凋亡功能。我们之前的研究发现，细胞可渗透的负显性TmSm34可以诱导包括乳腺癌Bcap-37、胰腺癌SW1990和肝癌SMMC-7721在内的多种癌细胞的凋亡，并且能够提高多种乳腺癌，包括T47-D，MCF-7和Bcap-37对化疗药物ADM的敏感性，进一步的研究表明TmSm34还能抑制乳腺癌CSCs的生长且诱导其凋亡。TmSm34诱导细胞凋亡的机制是通过消除p34cdc2-cyclinB1的磷酸化位点，进而阻止了Survivin与Caspase结合，最终诱导细胞凋亡。Survivin第48位Thr同样是一个磷酸化位点，T48A可以诱导肿瘤坏死因子TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)介导的凋亡。Survivin BIR结构域中的第84位Cys是Zn²⁺结合位点，而C84A可以破坏Zn²⁺配位球的完整性并抑制Survivin与Smac/DIABLO的相互作用，进而诱导细胞凋亡。不同的Survivin突变体可诱导细胞不同程度的凋亡，然而，究竟哪种Survivin突变体的抗癌活性最好，目前无统一定论。