[发明专利]一种变形假单胞菌HtpG抗原及其多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种变形假单胞菌HtpG抗原及其多克隆抗体的制备方法，其特征在于:包含以下步骤：

步骤(1)从样品中获取HtpG蛋白质抗原；

步骤(2)从HtpG蛋白质抗原中获取HtpG抗原的核酸，该核酸为蛋白氨基酸；

步骤(3)构建重组质粒：将步骤2中的HtpG抗原人工合成HtpG基因，将HtpG基因插入pET-32表达载体，并挑选阳性克隆测序验证步；骤(4)小样表达：将步骤(3)所述构建好的质粒转化BL21 DE3感受态细胞，培养、诱导、裂解、离心，得到蛋白质菌株，采用SDS-PAGE检测蛋白表达情况；

步骤(5)大样表达：选择步骤(4)所得良好的菌株进行接种、培养、诱导、裂解、纯化，得到HtpG蛋白质，采用SDS-PAGE鉴定蛋白分子量、纯度及浓度；

步骤(6)以步骤(5)制备所得HtpG蛋白质为抗原进行动物免疫；

步骤(7)采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清并纯化，即得HtpG抗体。

2.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌HtpG抗原及其多克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中构建重组质粒的方法具体为：按照大肠杆菌的密码子偏好，人工合成HtpG基因并将其插入pET-32表达载体中；pET-32表达载体为氨苄抗性，含有Trx标签及6xHis标签；Trx标签为硫氧还蛋白标签，分子量为20kDa，在pET-32表达载体中位于目的基因的N-端；将构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α中，使用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，在37℃下培养12h，挑取单菌落后摇菌，提取质粒并测序，测序正确的即为所需重组质粒。

3.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌HtpG抗原及其多克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中小样表达的具体方法为：将步骤(3)构建好的重组质粒转化BL21DE3感受态细胞，接种抗性LB平板培养基，生长24小时；挑选转化为平板的6个单克隆，分别接种3ml抗性液体培养基；在37℃温度中，220RPM培养至OD600nm值为0.5-0.6之间，；加入0.5mM IPTG，在20℃温度中，诱导表达3.5小时；离心收集菌体，进行超声破碎，SDS-PAGE检测表达情况。

4.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌HtpG抗原及其多克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)大样表达的具体方法为：选择所述步骤(4)中小样表达良好的菌株接种60μl菌种至200ml抗性培养基中，在37℃温度中，220RPM培养24小时；加入新鲜抗性培养基至800ml，培养1-2h至OD600nm值为0.5-0.6之间，；加入200μl的1M IPTG，在28℃或37℃温度中诱导表达3.5h；4℃离心收集菌体，收集的转速为66转/秒×15min，沉淀并废弃上方清液，加入30ml PBST悬浮菌体，加入终浓度1mM PMSF，冰浴条件下选用200W超声波破碎6min；摇床4℃孵育1h；133转/秒高速离心15min，取上方清液，加入400μl镍柱4℃结合24小时；收集镍柱，收集的转速为33转/秒×5min，20mMimidazole洗涤液洗涤beads，洗去杂蛋白；加入300ul 300mM imidazole洗脱液,让洗脱液与beads充分结合1h，离心收集上方清液；向beads中再次加入300μl的洗脱液，洗脱1h，离心收集上方清液，两次洗脱液合并加入一个试管；用PBS透析换液；用SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量、纯度及浓度。

5.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌HtpG抗原及其多克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(6)中选用的免疫动物为2-3月龄日本大耳白Balb/C兔，免疫方法采用背部多点注射，免疫周期为64天。

6.根据权利要求1所述的一种变形假单胞菌HtpG抗原及其多克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(7)中抗血清制备的方法具体为：以常规方法将1mg纯化蛋白质共价连接至溴化氢活化的Sepharose4B柱，制备亲和纯化柱；10ml抗血清与亲和纯化柱孵育24小时；pH5.0 HCl预洗，除去杂抗体；pH2.5，0.15M glycine缓冲液洗脱，10xPBS缓冲液迅速中和，制备亲和纯化抗体；用PBS缓冲液透析换液，即得HtpG抗体。