[发明专利]一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法；包括以下步骤：首选，根据前期基因组测序所获得的变形假单胞菌LexA基因序列，人工合成LexA基因并插入pET‑32表达载体，挑选阳性克隆测序验证；然后，将构建好的质粒转化BL21DE3感受态细胞，培养、诱导、裂解、离心，得到蛋白质，SDS‑PAGE检测蛋白表达情况；进一步，选择小样表达良好的菌株进行接种、培养、诱导、裂解、纯化，得到蛋白，SDS‑PAGE鉴定蛋白分子量、纯度及浓度；进一步，以所得LexA蛋白质为抗原进行动物免疫，收集抗血清并进行纯化，即得LexA抗体。经间接ELISA法检测抗血清及亲和纯化抗体效价，结果显示亲和纯化抗体得率正常。本发明方法简单，制备的抗体免疫原性强。

技术领域

本发明涉及生物技术领域的抗体及其制备方法，具体是一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法。

背景技术

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)是中国近海特有的主要经济鱼类和当前单一品种养殖量最大的海水鱼类，也是中国八大优势出口水产品之一。目前大黄鱼的全国年育苗量超过30亿尾，养殖产量近20万吨，直接产值超百亿元，已成为我国海水养殖业的重要支柱产业之一。但是，近年来随着大黄鱼养殖业的迅速发展，大黄鱼各种疾病频繁爆发。其中“内脏白点病”是近几年网箱养殖大黄鱼最常见的病害之一，患病大黄鱼死亡率可高达80％，每年造成上亿元的直接经济损失。因此，如何有效的防治大黄鱼疾病的爆发，对该产业可持续健康发展具有重大的意义。

目前，变形假单胞菌是大黄鱼“内脏白点病”的病原菌的观点得到广泛认可。变形假单胞菌是需氧、具有极生鞭毛的革兰氏阴性杆菌。研究发现，变形假单胞菌人工感染也可引发石斑鱼“内脏白点病”。鉴于变形假单胞菌对大黄鱼养殖业的巨大危害，其致病机理的研究引起了广泛关注。申请者所在课题组于2013年4月从患“内脏白点病”的大黄鱼中分离得到变形假单胞菌的高致病性NZBD9菌株，并对其致病机理展开了系统研究。我们发现变形假单胞菌的多种毒力基因的启动子中含有转录因子LexA(locus for X-ray sensitivityA)结合位点。因此，我们构建了变形假单胞菌lexA敲除菌株，并对其重要毒力指标进行检测，结果显示：ΔlexA的毒力、成膜能力、运动能力、胞内存活能力和免疫逃逸能力相较于野生株都有显著增强。由此可见，LexA在变形假单胞菌毒力调控中扮演重要角色。

因此，研究LexA蛋白的生物学功能及相关的分子调控机制对于变形假单胞菌致病机理的探索、新型药物靶点的筛选以及高效疫苗的研发具有重要的意义。在蛋白质生物学功能及相关分子调控机制的研究过程中，抗体的使用是不可避免的，然而目前市面上并未有商品化的变形假单胞菌LexA抗体。此外，变形假单胞菌LexA蛋白与已报道的来自其他病原菌的LexA蛋白在氨基酸组成上有一定区别。例如，变形假单胞菌与大肠杆菌LexA氨基酸序列的相似性仅为60.26％。因此，本发明首次表达获得了变形假单胞菌转录因子LexA抗原并制备得到相应的LexA抗体，将对“内脏白点病”的进一步研究与防治提供有力支撑。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明首次表达获得了变形假单胞菌转录因子LexA抗原并制备得到相应的LexA多克隆抗体。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种变形假单胞菌转录因子LexA多克隆抗体的制备方法，包含以下步骤：

步骤(1)编码蛋白质LexA抗原的核酸的碱基序列；该抗原为蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；该核酸的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

步骤(2)将人工合成LexA基因插入pET-32表达载体，并挑选阳性克隆测序验证,形成重组的质粒；

步骤(3)将步骤(2)所述构建好的质粒转化BL21 DE3感受态细胞经过培养、诱导、裂解、离心，得到蛋白质菌株，采用SDS-PAGE检测蛋白表达情况；