[发明专利]婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法

权利要求书

1.婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，其特征在于，包括HPLC法检测叶酸含量标准曲线的构建、婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备、叶酸含量HPLC法检测、叶酸含量检测校正集样本和验证集样本的设计、叶酸含量均衡稳定性判断模型的构建、婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型的验证6个基本步骤，构建出一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型为Y＝0.876X+11.131，R²＝0.944，其中Y为国标微生物法测定12g样品中叶酸含量，单位为μg；X为液相色谱HPLC法测定12g样品中叶酸含量，单位为μg；模型F统计量值＝1137.735，P值0.05，模型在校验水平0.05显著，且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024，具体包括以下步骤：

1)所述的HPLC法检测叶酸含量标准曲线的构建，包括叶酸标准溶液的配制、液相色谱HPLC检测条件的设定、叶酸标准溶液的HPLC法检测、叶酸HPLC检测标准曲线的构建4个基本环节；

叶酸标准溶液的配制：称取0.0100～0.0115g叶酸标准品于50mL容量瓶中，加入适量0.5％氨水，利用超声频率20～40kHz进行超声处理10～30min使叶酸完全溶解，再用0.5％氨水定容至刻度，得到浓度为200～230μg/mL的叶酸标准品储备液；再将叶酸标准品储备液分别加水稀释4000倍、2000倍、400倍、200倍、100倍的浓度梯度的叶酸标准溶液备用；

液相色谱HPLC检测条件的设定：是选用250mm×4.6mm，5μm的C₁₈色谱柱和荧光检测器；检测波长为λex＝344nm和λem＝428nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液；流速设定为1.0mL/min，进样量为25μL，柱温为40℃；样品检测时间为25.0min，其梯度洗脱程序如下：

叶酸标准溶液的HPLC法检测：将0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL浓度梯度的叶酸标准溶液依次进行液相色谱HPLC检测，准确记录每个叶酸标准溶液的液相色谱图谱备用；

叶酸HPLC检测标准曲线的构建：计算每个叶酸标准溶液液相色谱图谱中对应叶酸的峰面积；以叶酸标准溶液浓度下所对应的峰面积值为纵坐标，以叶酸标准溶液的浓度为横坐标，绘制叶酸浓度与峰面积间的标准曲线，并求得叶酸检测的标准曲线回归方程；

2)所述的婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备，是准确称量1.0000～1.0015g婴幼儿辅食营养包内容物置于100mL离心管中，加入预先配制体积比为20～30:80～70的乙腈与乙酸-乙酸钠缓冲液的混合液25.0mL，涡旋混匀后，利用超声频率20～40kHz进行超声处理10～30min，再置于低温高速离心机中设定离心温度4℃、6000r/min条件下离心10～20min；取上清液5.0mL置于离心管中，再加入10.0mL正己烷，涡旋混合1～3min；再置于离心温度4℃，6000～10000r/min条件下离心5～10min，取下层液，经0.22μm滤膜处理，收集滤液置于棕色进样瓶中备用；

3)所述的叶酸含量HPLC法检测，是经步骤2)制备的待检样品，利用步骤1)设定条件进行液相色谱HPLC检测获得色谱图，计算谱图中叶酸对应峰面积代入所构建的叶酸检测标准曲线回归方程，求得所检婴幼儿辅食营养包内容物叶酸浓度，再利用如下公式计算所检婴幼儿辅食营养包内容物叶酸的含量；

式中：S为叶酸含量，单位μg/g；A_mt为叶酸浓度，单位μg/mL；V为待检样品稀释体积，单位mL；m为测试样品质量，单位为g；

4)所述的叶酸含量检测校正集样本和验证集样本的设计：将75个婴幼儿辅食营养包待测样本随机分为70个校正集样本和5个验证集样本，依次按照GB5009.211-2014叶酸测定方法与上述液相色谱HPLC方法进行叶酸含量分析，获得75个样品两种检测方法对应的叶酸含量数据备用；

5)所述的叶酸含量均衡稳定性判断模型的构建，基于婴幼儿辅食营养包中强化叶酸含量是线性关系原因，以70个校正集婴幼儿辅食营养包叶酸含量为数据源，基于一元线性回归方法构建的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性判断模型：Y＝0.876X+11.131，R²＝0.944，其中Y为国标微生物法测定叶酸含量，单位为μg/12g，X为液相色谱HPLC法测定叶酸含量，单位为μg/12g，模型F统计量值＝1137.735，P值0.05，且模型在校验水平0.05显著；

6)所述的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型的验证：以5个验证集样本叶酸含量结果为模型验证数据源，带入5)所构建的两个婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性判断模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024。