[发明专利]一种基于实时荧光RPA技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于实时荧光RPA技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用，所述试剂盒成套试剂，由引物对和名称为YPS723‑1‑P1的探针组成，所述引物对由名称分别为YPS723‑F1和YPS723‑R1的单链DNA组成。本发明的试剂盒能够快速、便携、灵敏度高、特异性好的检测鼠疫耶尔森菌，有望成为临床样本的快速诊断辅助工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种基于实时荧光RPA技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用。

背景技术

鼠疫(plague)是由革兰氏阴性菌鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis，以下简称“鼠疫菌”)引起的烈性传染病，可通过跳蚤在啮齿类动物中引起大规模流行。居住在鼠疫疫源地附近的人类可通过接触感染的动物或者跳蚤叮咬而被感染。鼠疫在人与人之间可通过污染性气溶胶进行传播，且有效传播距离仅需2米，如果患者在症状出现后不尽快进行抗生素治疗，很可能危及生命。此外，鼠疫菌一直被认为是典型的生物战剂之一。目前，鼠疫在全世界已造成2亿多人死亡。在我国，自然疫源地的鼠间鼠疫一直存在，而近年来出现的人间鼠疫(2019-2020年先后确诊7例鼠疫患者)引起人们的广泛关注。鼠疫因其传染速度快、传染性强、发病急剧、致死率高等特点，如果防控不及时，极易形成大流行，引起公众恐慌和社会混乱。为了能够实现对该菌疫源地的快速筛查和精准医疗的实施，及时预防和控制鼠疫，降低对人类社会带来的恶劣影响，快速准确诊断该病原体尤为重要。目前，公认检测鼠疫菌的常用方法主要有分离培养病原菌，酶联免疫吸附测定(ELISA)，实时荧光PCR(qPCR)等。这些方法虽然可准确的检测到鼠疫菌，但是较长的测定时间(不少于几个小时)，昂贵精密的仪器(如，qPCR仪器)，专业的生物技术人员和较高的实验环境要求限制了野外及现场检测。

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)是近年来新兴的一项核酸检测技术，目前已用于多种传染源的核酸检测。常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可快速进行^[5]。优化后的RPA引物一般可在39℃左右十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

发明内容

本发明的目的在于：应用实时荧光RPA技术为鼠疫的现场快速诊断和流行病调查提供一种全新的技术支持。

本发明提供一种成套试剂，由引物对和名称为YPS723-1-P1的探针组成，所述引物对由名称分别为YPS723-F1和YPS723-R1的单链DNA组成；

所述YPS723-F1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述YPS723-R1为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a4)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述YPS723-1-P1依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；所述DNA片段甲为序列4所示的单链DNA分子；所述DNA片段乙为序列5所示的单链DNA分子。

其中，所述YPS723-F1、所述引物YPS723-R1和所述探针YPS723-R1的摩尔量比为7:7:2；