[发明专利]一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法

权利要求书

1.一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1、对人体皮肤成纤维细胞进行扩增培养；

S2、换用无血清培养基，对扩增后的人体皮肤成纤维细胞进行饥饿培养，饥饿培养过程中切换至无氧状态，并通入少量一氧化氮对人体皮肤成纤维细胞进行刺激；

S3、取上清液，并通过滤膜过滤除去细胞和细胞碎片；

S4、通过超速离心法，分离上清液中的外泌体；

在步骤S1中，人体皮肤成纤维细胞采用悬浮培养；

在步骤S2中，饥饿培养至8～15h后，将人体皮肤成纤维细胞转至无氧培养箱中，培养2～3h后，通入一氧化氮，继续培养10～15h，随后停止通入一氧化氮，并继续培养至结束；在无氧培养箱中，一氧化氮的分压占总分压的0.01～0.1%，二氧化碳的浓度为5%。

2.根据权利要求1所述的一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在无氧培养箱中，二氧化碳的浓度为10～12%，并在培养基中加入3～4g/L的碳酸氢钠。

3.根据权利要求1所述的一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在步骤S2中，换用无血清培养基对人体皮肤成纤维细胞进行饥饿培养的同时，加入脂多糖，脂多糖的加入量为0.05～0.1μg/mL。

4.根据权利要求3所述的一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法，其特征在于，在步骤S2中，换用无血清培养基时，将脂多糖掺入无血清培养基中，涡旋均匀后，再用于人体皮肤成纤维细胞的培养。