[发明专利]一种RT-RAA荧光法检测HIV-1病毒不同亚型通用引物、探针及检测方法

说明书

一种用于检测HIV‑1病毒核酸的恒温荧光扩增引物组探针组、试剂盒及检测方法，具有耗时短、易于操作的特点。引物探针组的核苷酸序列为：上游引物的基因序列为SEQ ID NO.1，下游引物的基因序列为SEQ ID NO.2；探针的的基因序列为SEQ ID NO.3。探针具体为核苷酸序列的第30位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。试剂盒含有上述引物组探针组。本发明的引物探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。本发明的RT‑RAA一步法检测HIV‑1病毒RNA，30分钟内可以完成检测，可成为HIV‑1病毒核酸的现场快速检测方法。

技术领域

本发明涉及病毒检测热技术领域，特别是涉及一种用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物组、探针、方法及试剂盒。

背景技术

目前HIV-1病毒核酸检测应用最为广泛的方法为聚合酶链式反应(PCR)技术，包括多重PCR、巢氏PCR以及实时荧光定量PCR技术在内的HIV-1核酸PCR检测方法等,需要经过变性、退火、延伸等热循环过程才能实现核酸的扩增检测，不仅需要专业的仪器设备以及技术人员，而且整个检测时间通常在2-4小时，限制了其在基层的应用和现场快速检测的需要。近年来发展起来的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)采用链置换活性的DNA聚合酶，根据DNA复性及延伸在60-65℃完成，且核酸在该温度下处于动态平衡状态的原理，实现在该温度条件下恒温扩增的目的，不需要专业的热循环扩增仪器且避免了热循环而造成的时间损失，扩增过程通常在30-60分钟内完成。而且LAMP技术针对目标序列的6个区域设计4条特异性的引物，扩增效率高，灵敏度和特异性较好，但是与传统的PCR方法相比，对引物设计的要求较高。

因此，针对现有技术不足，提供一种耗时短、易于操作的用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物组、探针、方法及试剂盒以克服现有技术不足甚为必要。

说明本发明的目的(客观评价)：

本发明的目的在于提供一种耗时短、易于操作的快速检测HIV-1病毒核酸的引物和探针组及检测方法。本发明采用逆转录-重组酶介导的扩增技术一步法检测HIV-1病毒RNA。该技术的原理是反应体系中的重组酶、单链结合蛋白、引物形成的复合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋，单链结合蛋白阻止单链DNA复性，在能量和dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶介导完成链的延伸。本发明检测过程是在RAA反应体系中加入逆转录酶，以病毒RNA为模板，实现DNA的扩增，无需先将HIV-1病毒RNA逆转录为cDNA，再高温使DNA解旋，只需在37～42℃条件下同步进行逆转录及等温扩增，30分钟内可以完成检测。该技术不依赖于传统PCR方法的热循环解链，主要由重组酶和聚合酶介导完成，可以实现恒温扩增，不需要专业的热循环扩增仪器且避免了热循环而造成的时间损失。同时在反应体系中加入荧光探针，随着扩增产物的增加，荧光信号随之累积，实现实时检测。相对于LAMP技术，扩增温度更低，且对引物的设计要求更低。在本发明中，我们通过对从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中下载的60条，包括HIV-1主要基因型和中国常见的流行重组病毒(circulating recombinantforms,CRF)全基因序列分析后，选择较为保守的pol基因序列进行引物和探针设计。通过筛选，优选出最佳的引物探针组可以同时实现目前中国比较流行的HIV-1B、HIV-1CRF01-AE，HIV-1CRF-07BC，HIV-1CRF-08BC亚型样本的核酸检测。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物探针组、试剂盒及检测方法，具有耗时短、易于操作的特点。

本发明的目的通过以下技术措施实现。

提供一种用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物探针组，引物探针组的核苷酸序列为：