[发明专利]非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用

权利要求书

1.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQ ID NO.20所示；所述基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第184062-184456位。

2.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQ ID NO.20所示；所述基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第184062-184456位。

3.一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的基因Ⅱ型非洲猪病毒，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQ ID NO.20所示；所述基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第184062-184456位。

4.一种非洲猪瘟减毒疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟减毒疫苗包括权利要求3所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株。

5.一种制备权利要求3所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段将全基因序列如SEQ ID NO.20所示的ASFV CN/GS/2018分离株的第184062-184456位核苷酸序列缺失。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为同源重组技术。

7.一种制备权利要求5-6任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）pX330载体优化；通过ClonExpress II一步法克隆法去除pX330载体中Cas9酶两端的核定位信号NLS，命名为pX330ΔN；

（2）设计靶向寡核苷酸181/UK-gRNA-L和181/UK-gRNA-R，将寡核苷酸配对插入pX330-ΔN载体中，制备阳性克隆质粒pX330ΔN-181/UKL和pX330ΔN-181/UKR；其中，所述181/UK-gRNA-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，181/UK-gRNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

（3）设计MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因组合片段的上下游序列作为同源重组臂，并同时克隆入pUC19载体中，获得重组转移载体p181/UKLR；

（4）在重组转移载体p181/UKLR左、右臂基因序列中间插入eGFP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40poly，获得同源重组转移载体p181/UKLR-eGFP；

（5）将同源重组转移载体p181/UKLR-eGFP、pX330ΔN-181/UKL、pX330ΔN-181/UKR和JetPEI^®-Macrophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪的BMDM细胞，直接感染ASFV CN/GS/2018分离株；所述ASFV CN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQ ID NO.20所示；

（6）病毒株筛选：利用181/UK-check-F/R引物对重组病毒株筛选，获得基因片段缺失的减毒非洲猪瘟病毒株Δ181/UK，所述181/UK-check-F/R引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.16-17所示。