[发明专利]一种检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法

权利要求书

1.一种检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)免疫组织化学方法处理肿瘤组织；

(B)激光捕获显微切割方法捕获所需细胞；

(C)单细胞测序技术分析人类肿瘤干细胞的少量但关键的遗传和表观遗传变化。

2.根据权利要求1所述的检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、脑胶质瘤、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、头颈鳞癌、皮肤癌。

3.根据权利要求1所述的检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法，其特征在于，所述的步骤A免疫组织化学方法中对肿瘤组织采用冷冻切片或石蜡包埋切片的处理方法。

4.根据权利要求1所述的检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法，其特征在于，所述的步骤C采用全外显子测序分析人类肿瘤干细胞的关键遗传变化，采用全基因组亚硫酸氢盐测序分析人类肿瘤干细胞的少量的关键表观遗传变化。

5.根据权利要求4所述的检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法，其特征在于，所述的人类肿瘤干细胞的少量的关键表观遗传变化为DNA甲基化变化。

6.根据权利要求1所述的检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)免疫组织化学和激光捕获显微切割：

将OCT包埋的冷冻肿瘤组织和癌旁组织切成10μm厚的切片，然后贴在PEN膜载玻片上；EpCAM的IHC后，通过在50ml无菌离心管中增加乙醇浓度使组织脱水，分别为50、75、85、95、100和100％乙醇，每次60s；当膜片完全干燥后，用Leica LMD 7000激光显微切割系统启动LCM程序；所有捕获的样品收集在0.2ml PCR管中；最后，膜片经过二甲苯透明，封片后长期保存；

b)遗传文库：

通过Quick-DNA Microprep Plus试剂盒从LCM样品中提取超低DNA，然后使用REPLI-g单细胞试剂盒，基于单细胞多重置换扩增技术，对微量DNA进行扩增；获得高质量的全基因组DNA扩增产物后，使用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行全基因组外显子捕获和文库构建；全基因组文库由QIAseq FX单细胞DNA文库试剂盒构建；

c)全基因组亚硫酸氢盐测序文库：

利用EZ DNA甲基化直接试剂盒，用1mg/ml蛋白酶K将LCM的组织样品消化长达4小时；彻底消化后，将显微切割收集的细胞立即用Pico Methyl-Seq文库制备试剂盒，进行超低量DNA文库的构建，并稍作调整：将亚硫酸氢盐转化时间延长至90分钟以确保完全转化；对于M1BULK样品，该文库在第4步骤中仅需要6个循环，而其他文库则需要11个循环；

d)测序：

所有文库均使用Illumina Xten平台进行测序，产生150bp双端reads；

e)采用全外显子测序分析人类肿瘤干细胞的关键遗传变化，采用全基因组亚硫酸氢盐测序分析人类肿瘤干细胞的少量的关键表观遗传变化；所述的人类肿瘤干细胞的少量的关键表观遗传变化为DNA甲基化变化。

7.根据权利要求6所述的检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：所述的步骤e中采用全外显子测序比较肿瘤干细胞、肿瘤实质细胞、癌旁细胞的关键遗传变化。

8.根据权利要求6所述的检测肿瘤干细胞中遗传和表观遗传变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：所述的步骤e中采用全基因组亚硫酸氢盐测序比较肿瘤干细胞、肿瘤实质细胞、癌旁细胞的DNA甲基化变化。