[发明专利]一种细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法

权利要求书

1.一种细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：EVs和靶向配体之间通过linker A和linker B连接，将靶向配体偶联在EVs表面，即获得大量靶向配体修饰的EVs；其中，linker A插入到EVs磷脂双分子层或与EVs表面膜蛋白共价偶联，形成EVs-linker A；linker B与靶向配体共价偶联，形成靶向配体-linker B。

2.按照权利要求1所述的细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：所述EVs-linker A和靶向配体-linker B通过linker A和linker B之间点击化学反应，将靶向配体偶联在EVs表面，即获得大量靶向配体的EVs。

3.按照权利要求1或2所述的细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：所述linker A和linker B的两端分别含有化学活性基团，活性基团之间通过一定长度的聚乙二醇(PEG)相连接；其中，所述linker A和linker B相连的一端分别为点击化学基团对，使linker A和linker B之间发生点击化学反应；linker A另一端基团与EVs发生反应，linker B另一端基团与靶向配体发生反应；所述linker A和linker B相连的点击化学基团对为：1)基于铜(I)催化叠氮化物-炔烃反应的点击化学反应基团对；2)基于张力促进的1,3偶极环加成反应(SPAAC)的点击化学反应基团对；3)基于Diels-Alder反应的点击化学反应基团对；4)基于SH-ene反应的点击化学反应基团对。

4.按照权利要求3所述的细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：所述linker A与EVs发生反应的活性基团为带有与EVs膜蛋白表面巯基或伯胺基反应的基团物质或带有插入到EVs磷脂双分子层的基团物质。

5.按照权利要求4所述的细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：所述带有与EVs膜蛋白表面巯基或伯胺基反应的基团物质为马来酰亚胺(Maleimide)或N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)；带有插入到EVs磷脂双分子层的基团物质为甘油脂类、脂肪酰类、固醇类、甘油磷脂类、鞘脂类、异戊烯醇类、糖脂类及其衍生物。

6.按照权利要求3所述的细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：所述linker B与配体反应的基团为带有与配体表面巯基或伯胺基反应的基团物质，或在合成多肽、核酸和或小分子配体时，可直接将点击化学基团修饰上linker B。

7.按照权利要求1所述的细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：所述细胞外囊泡(EVs)包括外泌体(Exosome)、微泡(Microvesicle)、凋亡小体(Apoptoticbody)、细胞来源的细胞膜仿生囊泡(Cell-Derived Membrane Vesicle，CMV)或细胞膜包裹的仿生纳米颗粒。

8.按照权利要求1所述的细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：所述靶向配体是指能够特异识别目标组织或细胞的表面受体并与之相互作用的蛋白质、多肽、核酸或小分子。

9.按权利要求1～8任意一项所述的细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法，其特征在于：

(1)将linker A和linker B分别溶解在相应的溶剂中，获得linker A溶液浓度为10～100μM，linker B溶液浓度为10mM；

(2)将上述获得linker A溶液与EVs混合，linker B溶液与靶向配体混合，分别在pH值为6.5～8.0的溶液中，15～37℃旋转混匀1～2小时,其中，linker A的工作浓度为10～100μM，linker B和靶向配体的摩尔比为5:1～20:1；

(3)对上述获得的EVs-linker A和靶向配体-linker B分别纯化，纯化后EVs-linker A和靶向配体-linker B在37℃下点击化学反应30～120min，即获得表面修饰靶向配体的EVs。