[发明专利]禾谷缢管蚜实时荧光定量PCR检测的内参基因及其扩增引物和应用

说明书

本发明公开了禾谷缢管蚜实时荧光定量PCR检测用的内参基因及其扩增引物和应用。本发明利用荧光定量PCR技术建立了禾谷缢管蚜在不同试验条件下内参基因的筛选方法，最终筛选出EF‑1α、β‑actin、AK、TATA、GAPDH、GST、RPL13、RPS6、RPS18、18S或28S基因适宜作为禾谷缢管蚜实时荧光定量PCR检测用的内参基因。本发明进一步设计扩增所述内参基因的特异性定量引物，建立基于SYBR Green I染料技术的RT‑PCR方法，为研究禾谷缢管蚜功能基因或不同发育时期、不同地理种群、不同身体部位、不同翅型基因表达或不同处理条件下基因表达提供了准确和灵敏的实时荧光定量PCR检测方法。

技术领域

本发明涉及蚜科昆虫内参基因的筛选，尤其涉及禾谷缢管蚜内参基因的筛选，本发明进一步涉及它们作为内参基因应用于禾谷缢管蚜不同发育阶段、不同地理种群、不同身体部位、不同翅型以及不同处理条件下基因表达的实时荧光定量PCR检测中的用途，属于禾谷缢管蚜内参基因的筛选及应用领域。

背景技术

禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi(L.)属半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，是重要的小麦害虫之一，其广泛分布于世界各小麦种植区。禾谷缢管蚜在中国各麦区均有分布，1980年以来是黄淮麦区和长江中下游麦区的重要害虫，但近些年来，表现出成灾区向北方扩散且逐渐加重的趋势。目前，中国禾谷缢管蚜的防治仍以化学防治为主，但该虫为典型的R-对策害虫，具有个体小、内禀增长率高、世代周期短、繁殖率高、环境适应性强等多样的适应机制，以及无性和有性生殖共存的繁殖方式，能够快速的适应复杂多变的环境，即使遭遇恶劣的外界环境变化，如低温、暴雨、农药使用等导致其种群数量降低，但当环境条件适宜时，种群数量则能够在短时间得以迅速恢复。随着长年杀虫剂的大量、不合理使用，已造成禾谷缢管蚜对多种、不同类型杀虫剂敏感性下降，其抗药性水平逐年上升，使得防治难度不断增加。由于防治问题的存在，人们对麦蚜抗药性问题日益关注，禾谷缢管蚜抗药性的研究也日益深入。

在昆虫基因转录水平的研究中，实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)是一种检测特定基因mRNA表达水平和转录分析的有效手段。qRT-PCR技术具有实时检测、特异性强、快速灵敏、准确定量的优点，实现了传统PCR从定性到精准定量的飞跃。进行qRT-PCR试验时，内参基因必须在给定的实验条件下稳定表达。为促进基因表达研究，获得更准确的表达量数据，筛选相对稳定的内参基因是必要的基础工作。理想的内参基因要求不受外界任何环境因素影响，在不同实验条件下均能稳定表达。但是，大量研究表明，不存在绝对稳定表达的基因(Zhu,X.,Yuan,M.,Shakeel,M.,Zhang,Y.,Wang,S.,Wang,X.,Zhan,S.,Kang,T.and Li,J.(2014)Selection and evaluation of reference genes for expression analysisusing qRT-PCR in the beet armyworm Spodoptera exigua(Hübner)(Lepidoptera:Noctuidae).PlOS ONE,9,e84730.)。

在昆虫样本体内，同一基因在不同种类昆虫中的功能、表达水平存在差异。同样，候选内参基因的表达情况也会因为不同昆虫物种或不同实验条件而存在差异。随着qRT-PCR技术的广泛应用，研究发现，昆虫样品种类和实验条件的不同，持家基因的表达量在某些特定条件下会发生较大的变化，如果盲目地借鉴，可能影响最终定量结果的准确性。

发明内容

本发明的目的之一是提供禾谷缢管蚜的内参基因，尤其是提供禾谷缢管蚜不同发育阶段，不同地理种群，不同身体部位，不同翅型以及不同处理条件下能够进行稳定表达的内参基因。

本发明的目的之二提供扩增所述内参基因的特异性定量引物。

本发明的主要目的之三将应用所述的禾谷缢管蚜的内参基因以及特异性定量引物采用实时荧光定量PCR方法对于禾谷缢管蚜不同发育阶段，不同地理种群，不同身体部位稳定，不同翅型或不同处理条件下基因表达进行实时荧光定量PCR分析。