[发明专利]一种高特异性检测嗜肺军团菌的核酸适配体及其检测方法与应用

说明书

本发明涉及防控高致病性微生物领域，尤其涉及一种高特异性检测嗜肺军团菌的核酸适配体及其检测方法与应用。本发明的核酸适配体包括GGTACTTCC、GGGCA茎环结构和TGAAGTGTTTAGGA结构。本发明的高特异性识别嗜肺军团菌的核酸适配体，在荧光检测结果和解离常数检测结果中能够表现出对军团菌的选择性结合，表现出高特异性、高亲和力和高结合性，可以运用基于核酸适配体的嗜肺军团菌检测系统完成嗜肺军团菌及其相近种属的快速检测需要，防控高致病性微生物，对于有效的监控防治公共卫生环境中的嗜肺军团菌具有着十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及防控高致病性微生物领域，尤其涉及一种高特异性检测嗜肺军团菌的核酸适配体及其检测方法与应用。

背景技术

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)是近年来在世界各地频繁报道的一种革兰氏阴性条件致病菌。军团菌病最早于1976年首次报道。当年的7月23日，在美国费城召开的退伍军人大会上爆发了大规模的感染，导致22人死亡，数百人出现非典型肺炎的症状。次年，美国疾病预防控制中心(CDC)的科学家从病人的肺组织分离出致病的元凶：军团病杆菌(Legionnaires’disease bacterium,LDB)。1979年，美国CDC将军团病杆菌正式命名为嗜肺军团菌。此后世界各地时有军团菌病暴发的报道，我国也于1982年首次报道了军团菌感染的临床病例。

军团菌感染人类的主要途径是中央空调冷却塔工作时形成的含菌气溶胶。当免疫力低下的人群吸入含有军团菌的气溶胶时，军团菌会进入到肺部并感染肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage)，在其中增殖并扩散，引起可致命的急性呼吸道传染病。我国卫生部颁布的WS 394-2012《公共场所集中空调通风系统卫生规范》4.3中明确规定公共场所集中空调中不得检出嗜肺军团菌。但随着城镇的现代化程度越来越高，集中空调和供水系统等设施的使用范围不断扩大，由此而带来的军团菌病的潜在危害性也大大增加。尤其是在我国南方，夏季长时间开空调，封闭的公共场所里军团菌病更容易扩散传播，如何针对环境中及人体内的嗜肺军团菌进行快速的特异性检测是目前亟待解决的问题。

目前已有多种方法应用于军团菌的检测鉴定，这些方法都存在许多缺陷和局限性。首先，针对环境中的嗜肺军团菌的检测，GB/T 18204.5-2013《公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统》规定水中及空气中的嗜肺军团菌检测方法为分离培养法配合生化反应、血清分型鉴定，但由于嗜肺军团菌不易生长，分离培养很难得到嗜肺军团菌，研究表明该方法敏感度为10％～80％，稳定性和重复性差，导致该方法检测假阴性率很高，并且该方法检测周期为3-14天，检测时间非常长，不具有检测时效性。其次，针对人体感染嗜肺军团菌后的检测WS 195-2001《军团病诊断标准及处理原则》中规定的方法包括分离培养法、酶联免疫吸附法(ELISA)、扩增法(PCR)三大类。分离培养法的缺陷已经在上述说明，酶联免疫吸附法存在灵敏度低的缺陷，检测限一般≥1000CFU/mL。扩增法(PCR)需要昂贵的仪器设备，并且操作过程极易产生交叉污染，造成假阳性的出现。

核酸适配体(Aptamer)是一类在体外筛选的，能与相应目标物专一并紧密结合的一类单链寡核苷酸序列。核酸适配体可单独作为生物探针对目标生物进行检测识别，其优点在于：第一，特异性高，其单链寡核苷酸序列形成的二级或三级空间结构可与病原微生物表面复杂的靶结构(如表面抗原蛋白质空间结构、表面多糖类空间结构)特异性结合，从而达到捕捉和识别病源微生物的作用；第二，亲和力强，核酸适配体形成的特异性空间结构可有效的结合在目标生物靶标上，不易脱落；第三，灵敏度高，核酸适配体生物探针对目标生物的灵敏度一般为10-100CFU/mL，相比ELISA的方法进步一个数量级；第四，反应快速，核酸适配体生物探针可在5-15分钟内与目标生物快速结合，相比分离培养法3-14天检测周期，大大缩短了时间；第五，经济成本低容易制造，传统的抗体蛋白(单抗及多抗)生物探针在产业化生产时制作过程复杂成本高，而核酸适配体生物探针产业化简单，生产耗材成本低、制作过程简单，在获得序列顺序后，通过基因编辑技术可大量生产。近年，学者们通过指数富集系统进化技术(SELEX)，获得了个别病原细菌的特异核酸适配体。相关已有研究结果见下表1。