[发明专利]大蒜GMBFV,PVY,GCLV病毒RT-PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种大蒜GMBFV,PVY,GCLV病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包含以下引物对组合：大蒜螨传丝状病毒引物，其上游特异性PCR引物如SEQ ID NO.1所示、下游特异性PCR引物如SEQ ID NO.2所示；大蒜普通潜隐病毒引物，其上游特异性PCR引物如SEQ ID NO.3所示、下游特异性PCR引物如SEQ ID NO.4所示，马铃薯Y病毒的上游特异性PCR引物如SEQ IDNO.5所示、下游特异性PCR引物如SEQ ID NO.6所示。

2.一种利用权利要求1所述的试剂盒同时检测大蒜GMBFV,PVY,GCLV病毒的方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：

1) 取大蒜组织，提取大蒜组织的总RNA；

2) 以提取的RNA为模板，用6碱基随机引物反转录得到cDNA；

3) 以cDNA为模板，采用权利要求1所述试剂盒中的引物对组合对其进行PCR扩增；

4) 对PCR产物凝胶电泳，根据目的片段大小，检测大蒜组织中的病毒种类，其中，大蒜螨传丝状病毒GMBFV的特异扩增产物为625bp，大蒜普通潜隐病毒GCLV的特异扩增产物为450bp，马铃薯Y病毒PVY的特异扩增产物为272bp。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，RNA的提取方法为：每50-100 mg大蒜组织加入1mL TRIzol® RNA分离试剂，剧烈震荡30 s，室温放置5 min，加入0.2倍体积的氯仿剧烈震荡30 s，室温放置5 min，12000rpm、4℃离心10 min；取上清加入新离心管中，加入等体积氯仿剧烈震荡30 s，室温放置5 min，12000rpm、4℃离心10 min；取上层水相于一新的离心管，加入0.6倍体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀，12000rpm、4℃离心15min；保留离心管底的RNA沉淀，加入1mL 75%的乙醇（DEPC水配制）洗沉淀，涡旋混匀，4℃下8000rpm离心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟；将RNA溶于25-40μL双蒸水（DEPC水）中，55℃-60℃水溶10分钟，即得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1）还包括RNA检测方法，具体为：用琼脂糖凝胶电泳检测是否提出了RNA以及RNA是否降解，操作如下：用天平称取1g琼脂糖倒入三角瓶中，加入100mL 1×TAE，微波炉加热溶解琼脂糖；待凉至55℃-60℃时，加入5μL核酸染色剂GeneGreen并摇匀；然后倒入制胶模中，插入试样格；在冰板上加入1μL RNA上样缓冲液、4μL dd H₂O和2μL RNA 之后混匀；点样， 150V电泳20min；电泳结束后将胶置于凝胶成像仪中进行观察，依据条带分析提取的RNA质量。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中，反转录反应液：50μM 的Random6 mers lμL，10 mM dNTP 1μL，总RNA 4μL，不含RNA酶的双蒸水4μL；在PCR仪上65℃、5 min后冰上急冷进行变性；在上述反应液中加入5×PrimeScript® Buffer 4μL，40 U/μL 的RNA酶抑制剂0.5μL，200 U/μL的逆转录酶1μL，不含RNA酶的双蒸水4.5μL；反转录程序：30℃10 min，42℃ 50 min，95℃ 5 min，一次循环后冰上急冷，得到cDNA。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）中，配制PCR反应液为：10×PCR缓冲液2.5μL，双蒸水13μL，MgCl₂ 2.5μL，dNTP（2mM/mL） 2μL，cDNA 2.5μL，Taq酶0.5μL，上游特异性PCR引物 1μL，下游特异性PCR引物 1μL；PCR程序：94℃变性5 min，然后94℃ 30s，55℃30s，72℃ 1 min共35个循环；最后72℃延伸10 min。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，大蒜组织为大蒜嫩叶或愈伤组织。

8.一种用于多重PCR同时检测三种大蒜病毒的引物对组合，其特征在于：其由三对引物组合而成，所述引物分别如下：

大蒜螨传丝状病毒的上游特异性PCR引物如SEQ ID NO.1所示、下游特异性PCR引物如SEQ ID NO.2所示，大蒜普通潜隐病毒的上游特异性PCR引物如SEQ ID NO.3所示、下游特异性PCR引物如SEQ ID NO.4所示，马铃薯Y病毒的上游特异性PCR引物如SEQ ID NO.5所示、下游特异性PCR引物如SEQ ID NO.6所示。