[发明专利]一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法及其试剂盒有效
| 申请号： | 202110181076.9 | 申请日： | 2021-02-09 |
| 公开（公告）号： | CN112795673B | 公开（公告）日： | 2022-03-01 |
| 发明（设计）人： | 张清平;张懿翔;刘洋;王亮;张奕南;曲勤凤;杨捷琳;赵磊;诸佩菊;王越;赵国屏 | 申请（专利权）人： | 上海市质量监督检验技术研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12R1/01 |
| 代理公司： | 上海华工专利事务所(普通合伙) 31104 | 代理人： | 缪利明;赵孟琴 |
| 地址： | 200233 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 食品 中克罗诺 杆菌 crispr 检测 方法 及其 试剂盒 | ||
1.一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对；
步骤二、将步骤一的PCR扩增产物加入CRISPR反应体系进行CRISPR反应，CRISPR反应体系包括Cas12b蛋白、Cas12b-tracrRNA、crRNA和探针；
步骤三、检测CRISPR反应荧光强度变化，根据曲线判读待检测样品中是否存在克罗诺杆菌属核酸；
扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；
所述Cas12b-tracrRNA、crRNA和探针的序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQID NO.14所示。
2.如权利要求1所述的CRISPR检测方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为25μL，包括:PCR反应混合液12.5μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，余量为双蒸水。
3.如权利要求1所述的CRISPR检测方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃20s，60℃20s，72℃15s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
4.如权利要求1所述的CRISPR检测方法，其特征在于，CRISPR反应体系为20μL，包括：10×NEBuffer 3.1 2μL，5μM的Cas12b蛋白1μL，40U/μL的RNA酶抑制剂0.25μL，10μM的crRNA 1μL，10μM的Cas12b-tracrRNA 1μL和10μM探针1μL，PCR扩增产物2μL，余量为灭菌水。
5.一种用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒，其特征在于，包括扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对、Cas12b-tracrRNA、crRNA、探针和Cas12b蛋白；
扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述Cas12b-tracrRNA、crRNA、探针和Cas12b蛋白的序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14所示。
6.一种如权利要求5所述的用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒在检测食品中是否含有克罗诺杆菌属中的应用。
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