[发明专利]一种与子宫内膜容受性辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用

说明书

本发明公开了一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物，包括hsa‑miR‑16‑2‑3p、hsa‑miR‑92b‑5p、hsa‑miR‑130a‑3p、has‑miR‑9024‑3p的miRNA及其引物；本发明还提供一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物的应用，其特征在于：包括以下步骤：S1采集母本血液，制备上清液；S2离心柱过滤管中处理并分级过滤，制备miRNA粗品；S3制备miRNA样品；S4利用试剂盒将得到的miRNA合成cDNA，进行PCR扩增体系和程序，得到miRNA的含量数据；S5构建CT含量曲线，确定不同时期的不同miRNA含量；本发明的有益效果是：通过限定miRNA及其引物，以特异性筛选后的四个引物为检测基础，实现快速准确地鉴定子宫内膜容受期。

技术领域

本发明涉及基因工程及生殖医学领域，具体是一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物及应用。

背景技术

目前，中国不孕症的发生率约在15-20％，而且不孕不育患者的数量每年以数十万的速度递增。婚育年龄的推迟、工作压力的堆积以及生活方式的改变等因素直接或间接地减低了人们的生育能力。随着世界上首例试管婴儿的降生，体外受精-胚胎移植（IVF-ET）已成为不孕女性尽快获得妊娠的有效途径。尽管辅助生殖技术的发展和技术革新，使得大部分不孕症患者已经能够通过胚胎体外培养技术获得优质胚胎进而妊娠，但是仍有一部分优质胚胎在妊娠早期甚至极早期发生丢失。研究表明，胚胎因素和子宫内膜容受性因素与胚胎成功种植存在着一定的相关性。

子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚胎的能力，即允许受精卵定位、黏附、侵入并使内膜间质发生改变从而植入子宫内膜的一种能力。子宫内膜容受性有一定的时间限制，这段时间被称为“种植窗”期（Windows of Implantation，WOI）。“种植窗”期也称为容受期，一般出现在排卵后的6~8 d 或受精后的5~7 d，需要由黄体分泌的雌、孕激素的支持，同时也受多种基因、蛋白质、细胞因子和粘附分子的影响，而在辅助生殖中的体外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）中，通常会建立人工模拟月经周期，在子宫内膜达到7毫米时，通过给与不同剂型的黄体酮，使子宫内膜从增殖状态转化分化状态，这个给黄体酮的时机被称为黄体转化期，黄体转化期后的第3-5天可以把胚胎放入子宫内。正常情况下，只有黄体转化期后第5天左右，子宫内膜能容受胚胎，其他时候胚胎不被容受也就不会着床。

胚胎植入与种植窗口开放的同步化，是着床成功的必要条件，2/3 的反复种植失败的是由于子宫内膜容受性不足引起，因此良好的子宫内膜容受性是成功的胚胎植入必备条件。而目前的常规检测手段是先对子宫内膜进行活检，因活检为有创手术，因此需要在下一个IVF-ET周期进行胚胎移植，而两个周期之间存在不同的周期其容受性的误差，消耗大量时间的同时对母体的损害也不可逆。

而大量研究表明，子宫内膜容受性和多个基因（如同源框基因A10、同源框基因C8、半乳糖凝集素-3、单外显子基因叉头框L2、人类与果蝇ems 的同源结构域基因Emx2 等）、蛋白（如IV 型胶原蛋白、妊娠相关蛋白、雌激素受体、孕激素受体、骨桥蛋白、整合素等）、细胞因子（如LIF 、IGF1、白细胞介素Ⅰ、集落刺激因子Ⅰ、血管内皮生长因子等）、卵巢甾体激素等有关。

miRNA 是一种非编码RNA，高度保守，长度约18~22 核苷酸，通过靶向mRNA 进行切割或转录抑制来调节转录后水平的基因表达。miRNA 广泛存在于细胞和组织中，参与多种生物过程。研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。现有的成熟的技术，包括定性和定量miRNA分子的技术，表明利用血清miRNAs作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分子标记方法将更加有效，为生物标志物开拓了新境界。并且已有研究表明miRNA 的调节与生殖障碍有关，如多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、子宫内膜息肉、输卵管积水等。