[发明专利]一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法

说明书

本发明涉及一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，该方法包括亚洲棉种子的萌发、组织培养、酶解解离原生质体、离心收集原生质体以及显微观察鉴定等步骤。本发明从亚洲棉的根尖和叶片所解离的原生质体浓度较高(高于3000cells/μL)，且活率不低于92％，完全符合10×Genomics单细胞转录组测序的上机要求。因此本发明得出的根尖与叶片解离原生质体的方法，更好的解决了亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体解离困难以及活率低的难题，从而可以更好的研究棉花抗逆过程特定基因的表达，对于棉花的遗传发育与培育抗逆棉花的品种至关重要。

技术领域

本发明涉及一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，属于细胞生物学与普通生物学技术领域。

背景技术

植物细胞不同于动物细胞，它有细胞壁的保护。植物原生质体是指去除细胞壁的由细胞膜包裹的裸露细胞，本身具有细胞的全能性。目前植物细胞原生质体制备过程中，有两大难题，酶解时间与缓冲液渗透压。植物组织伴随着发育程度和功能的不同，具有不同的细胞壁厚度和液泡渗透压，这为不同植物组织间甚至是复杂植物组织内的单细胞分析造成了一定的障碍。

棉花是重要的经济作物，是纺织品的主要原料之一，在国民经济和人民生活中占有重要地位。亚洲棉是一个二倍体棉种，具有纤维强力高，抗逆性强等优良性状。尽管棉花是耐盐先锋作物，但耐盐能力有限，不足以对我国大环境的盐渍土壤形成耐受性。随着城镇化发展和人类活动对土壤环境的污染，可耕作土地面积逐渐减少，而粮棉争地的矛盾日益显现，培育适宜我国土壤和气候环境的耐盐和抗旱棉花品种显得尤为重要。

棉花根尖是面对非生物胁迫最先做出反应的部位，因此，研究根尖细胞的发育轨迹以及响应非生物胁迫的基因对于提高棉花耐盐与抗旱的特性至关重要。棉花叶肉细胞位于上、下表皮之间，叶肉细胞内含有大量的叶绿体，是植物进行光合作用的主要部分。

10×Genomics单细胞转录组测序是近几年在生物科研领域比较热门的技术之一。它不同于目前一般的普通转录组测序，可以很精确的研究植物细胞上的某一个部位，比如研究气孔谱系细胞的发育，研究雄性不育过程的花粉败育。而常规的转录组测序只能检测植物所有部位的平均表达量，往往解决不了细胞的异质性。

现有技术制备的棉花根尖细胞与叶肉细胞的原生质体，其数量与活率均不能满足10×Genomics单细胞转录组测序的上机要求，如何能制备出棉花根尖细胞与叶肉细胞的原生质体，使其数量与活率分别满足10×Genomics单细胞转录组测序的上机要求，从而可以更好的研究棉花抗逆过程特定表达的基因，对于棉花的遗传发育与培育抗逆棉花的品种至关重要。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，其包括如下步骤：

(1)培养获得亚洲棉的根尖和叶肉组织；

(2)将根尖与叶肉组织分别加入酶解液进行培养；

(3)向步骤(2)中处理后的酶解液中加入使原生质体释放的溶液(原生质体释放液)，之后细胞筛过滤，低速离心，弃上清；

(4)向步骤(3)中保留的溶液中加入原生质体释放液，重新悬浮原生质体，细胞筛过滤，低温低速离心，弃上清，加入原生质体释放液重新悬浮原生质体；

(5)将步骤(4)中获得的原生质体置于冰上，重新悬浮原生质体，取原生质体悬浮液加入台盼蓝染色液在载玻片上通过显微镜镜检，计算细胞数量与细胞活率。