[发明专利]一种肝脏类器官模型及其建立方法、用途以及治疗肝细胞铁死亡的药物组合物

权利要求书

1.一种2D肝样细胞铁过载模型的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括：

（1）利用离体iPS细胞分化获得2D肝样细胞；

（2）利用柠檬酸铁铵与所述2D肝样细胞接触，以便获得2D肝样细胞铁过载模型，

其中，所述iPS细胞源自哺乳动物的皮肤成纤维细胞；

所述iPS细胞中含有与线粒体DNA缺失综合征相关的DGUOK基因突变；

所述柠檬酸铁铵的浓度为5 mM。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述iPS细胞通过以下方法获取：

1）将含有OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC基因的病毒感染哺乳动物的皮肤成纤维细胞；

2）对感染后第六天的细胞进行分盘：将细胞用0.25%胰酶消化传代，按照每盘30-40×10⁴个细胞/6 cm盘的密度接种细胞，用4mL 再编程培养基2进行培养，每天更换培养基，感染后16天将所述再编程培养基2更换为mTeSR培养基继续培养，其中，接种细胞所用的盘为用Matrigel包被的盘；

3）根据培养获得的克隆的形态挑取iPS细胞克隆；

其中，所述再编程培养基2包括500mL F12培养基、10ml ITS、32mg维生素c、2.5g NaCl、5μg bFGF以及100μM丁酸钠。

3.一种利用权利要求1或2所述的建立方法获得的2D肝样细胞铁过载模型。

4.一种3D肝脏类器官铁过载模型的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括：

1）对权利要求1或2所述的建立方法获得的2D肝样细胞进行3D肝脏类器官培养，以便获得3D肝脏类器官；

2）利用柠檬酸铁铵与所述3D肝脏类器官接触，以便获得3D肝脏类器官铁过载模型，

其中，所述柠檬酸铁铵的浓度为5 mM；

进行所述3D肝脏类器官培养的方法包括：

（Ⅰ）将所述2D肝样细胞用Accutase消化10-15 min，加入DMEM/F12培养基重悬，弃上清；

（Ⅱ）用Matrigel重悬细胞，接种到培养板中，置于细胞培养箱培养20-30 min，待Matrigel凝固，加入肝类器官培养基，每3天换液一次；

（Ⅲ）在培养箱中培养14天后，按1:4比例进行传代，每3天换液一次，以便获得3D肝脏类器官。

5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述肝类器官培养基组成：

AdDMEM/F12、0.5％青霉素-链霉素、1％GlutaMAX、10 mM HEPES、1% B27 minusvitamin A、15％R-spodin1条件培养基、3μM ChIR99021、10 mM烟酰胺、10 nM胃泌素、50 ngmL^-1 EGF、20 ng mL^-1TGF-α、100 ng mL^-1 FGF7、100 ng mL^-1 FGF10、50 ng mL^-1 HGF、2 mMA83-01、10 µM Y-27632、1 µM地塞米松，10 ng mL^-1 Oncostatin M。

6.一种利用权利要求4或5所述的建立方法获得的3D肝脏类器官铁过载模型。

7.权利要求1或2所述的建立方法获得的2D肝样细胞铁过载模型、权利要求3所述的2D肝样细胞铁过载模型、权利要求4或5所述的建立方法获得的3D肝脏类器官铁过载模型、权利要求6所述的3D肝脏类器官铁过载模型在筛选药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗肝细胞铁过载或铁死亡。

8.一种筛选治疗肝细胞铁过载或铁死亡的药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求1或2所述的建立方法获得的2D肝样细胞铁过载模型、权利要求3所述的2D肝样细胞铁过载模型、权利要求4或5所述的建立方法获得的3D肝脏类器官铁过载模型、权利要求6所述的3D肝脏类器官铁过载模型中的至少之一与待测药物接触，所述2D肝样细胞和/或3D肝脏类器官中细胞内的游离铁含量降低、细胞还原型GSH含量升高、细胞中铁蛋白和溶酶体共定位降低、细胞脂质ROS降低中的至少之一，是所述待测药物能够治疗肝细胞铁过载或铁死亡的指示。