[发明专利]棉花GhALS突变型蛋白、基因及其分子标记和应用

说明书

本发明公开了一种棉花GhALS突变型蛋白，所述棉花GhALS突变型蛋白的氨基酸序列对应于野生型棉花GhALS的氨基酸序列的第642位由Ser突变为Asn。本发明还公开了该突变型基因、表达盒、重组载体或细胞，本发明还公开了突变型蛋白、突变型基因或核酸，表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。本发明还公开了抗除草剂棉花相关的dCAPs分子标记及其应用。本发明的分子标记可实现抗除草剂植物的分子鉴定和快速选育。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及抗除草剂的棉花突变体、抗除草剂的棉花乙酰乳酸合成酶突变蛋白、基因、分子标记及其应用。

背景技术

棉花是一个重要的战略经济作物，近几年每年的播种面积稳定在5000万亩左右。然而，我国棉田杂草危害严重，常年造成棉花的经济损失约14-16％(马小艳等，2010)。化学除草是目前广泛普及的稻田除草方式，包括除草剂的土壤封闭处理和除草剂的茎叶处理。化学除草有严格的的施用范围，除草剂使用不当会引发药害，造成减产甚至绝产。因此，培育抗除草剂的棉花品种是防治杂草、提高生产效率的有效途径。

目前，我国已经获得多个自主知识产权的抗草甘膦除草剂基因G10eve(G10-EPSPS、G10aroA)、EPSPS-G6、G2-aroA、GR79、GAT等及其相应的抗除草剂棉花转化体(陆国清等，2018；马燕斌等，2016；燕树锋等，2018；张小兵，2015)，但因转基因安全评价所需时间较长，目前还未能商业化。此外，我国也发掘、创制了多份非转基因抗草甘膦的棉花突变材料(巩元勇等，2014；燕树锋等，2016)，但因抗性水平未达大田应用水平，如R1098突变体对10％草甘膦水剂抗性较差(燕树锋等，2016)，也未商业化。总之，我国可利用的抗除草剂棉花种质不多，目前没有商业化推广应用的抗除草剂棉花品种。因此，发掘新抗除草剂基因、创制抗除草剂棉花新种质、培育抗除草剂棉花新品种对我国棉花的轻简化栽培和优质高效生产具有重大意义。

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)，也称乙酰羟酸合成酶，是支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成的第一个关键酶，是磺酰脲类(Sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones，IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines，TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(or oxy)-benzoates，PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones，SCT)等ALS抑制剂类除草剂的作用靶标。ALS某些氨基酸位点的突变可使得植物对ALS抑制剂类除草剂产生抗性。国际除草剂抗性行动委员会HRAC归纳统计的可产生除草剂抗性的ALS突变位点包括：Ala 122、Pro 197、Ala 205、Asp 376、Arg 377、Trp 574、Ser 653、Gly 654(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)，这些突变在多种农作物(包括水稻、玉米、小麦、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。

棉花含有6个不同的ALS基因(John W.Grula等，1995)；可能鉴于多拷贝的缘故，棉花ALS基因突变产生除草剂抗性的相关研究报道较少。棉花愈伤组织经过SU除草剂筛选、组培再生获得2株同时抗SU、IMI除草剂的突变体植株，分别发生了Trp563Ser、Trp563Cys突变，但该两抗性株均败育，未能收获下一代(Rajasekaran等，1996)。棉花种子经EMS诱变获得了4份抗IMI除草剂的棉花种质EM₄-3-1、SCM₃-4-3、SCM₃-7-3和RM₃-8-1，它们可抗16倍大田推荐施用浓度的甲氧咪草烟(imazamox)，等位性测验表明这4份种质的抗性基因可能是同一基因或紧密连锁，但未克隆到抗除草剂基因(Bechere等，2010)。